[摘要] 目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对氧化应激诱导的大鼠H9C2凋亡的细胞保护作用及机制。方法 H9C2细胞传代培养后进行随机分组。阴性对照组（正常培养液培养），H2O2损伤组（100 μmol/L H2O2作用12 h），EGCG低浓度组（10 μmol/L EGCG孵育24 h后，加入H2O2作用12 h），EGCG高浓度組（100 μmol/L EGCG孵育24 h后，加入H2O2作用12 h）。MTT比色法检测细胞活力，Hochest33258染色观察凋亡细胞形态，流式细胞仪检测细胞凋亡率，比色法检测凋亡相关因子Caspses-3及Caspase-9的表达。 结果 10 μmol/L及100 μmol/L的EGCG作用于H9C2细胞后，细胞存活率分别提高到66.68%和78.63%，与H2O2损伤组（57.33%）比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；Hoechst33258染色及流式细胞技术结果显示，不同浓度的EGCG作用于H9C2细胞后，细胞凋亡率逐渐下降，与氧化损伤组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；此外，EGCG能够有效抑制H9C2细胞内Caspase-3、Caspase-9的表达。 结论 EGCG通过抑制Caspses-3及Caspase-9的表达有效抑制了H9C2细胞的氧化损伤，从而为其用于治疗心肌细胞损伤提供可靠的实验依据。
[关键词] 表没食子儿茶素没食子酸酯；H9C2细胞；Caspses-3；Caspase-9；凋亡
[中图分类号] R54 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（c）-0034-04
[Abstract] Objective To discuss the protective effects and possible mechanisms of epigallocatechin gallate （EGCG） in oxidative damage of rat H9C2 cells induced by oxidative stress. Methods H9C2 cells were random grouped after subcultured. There were negative control group （cultured with normal nutrient solution）， H2O2 injury group （incubated with 100 μmol/L H2O2 for 12 h）， EGCG low dose group （incubated with 10 μmol/L EGCG for 24 h then cultured with 100 μmol/L H2O2 for 12 h） and EGCG high dose group （incubated with 100 μmol/L EGCG for 24 h then cultured with 100 μmol/L H2O2 for 12 h）. Cell viability were tested by MTT colorimetric detection， apoptotic cell morphology was observed by Hochest33258 staining， apoptosis rate was detected by flow cytometry， expression of apoptosis-related factors Caspses-3 and Caspase-9 were tested by colorimetric detection. Results The cell survival rate increased to 66.68% and 78.63% after treated with 10 μmol/L and 100 μmol/L EGCG compared with H2O2 injury group （57.33%）， with statistically significant difference （P < 0.05）. Hoechst33258 dying and flow cytometry technology results showed that cell apoptosis rate dropped gradually after treated with different concentration of EGCG with H2O2 injury group， with statistically significant difference （P < 0.05）. Besides， the expression of Caspase-3 and Caspase-9 were inhibited after treated with EGCG. Conclusion EGCG effective inhibit H9C2 cells oxidative damage by inhibiting the expression of Caspses-3 and Caspase-9， which provide reliable experimental basis for the treatment of injuries in myocardial cells.
[Key words] Epigallocatechin gallate； H9C2 cells； Caspses-3； Caspase-9； Apoptosis
人体的许多疾病都与细胞的氧化损伤和凋亡密切相关，其中，氧化应激损伤诱导的心肌细胞凋亡与心肌缺血、冠状动脉粥样硬化性心脏病等多种疾病的发生有关[1-4]。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是从天然植物绿茶中提取的一种儿茶素单体。EGCG具有很强的抗氧化能力，长期饮用绿茶可以明显改善心肌细胞功能，降低心肌的缺血再灌注损伤[5-6]。本研究通过在培养基中加入外源性活性氧H2O2诱导鼠H9C2心肌细胞凋亡，探索EGCG对氧化应激引起细胞凋亡保护作用及机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
大鼠H9C2心肌细胞株（中国科学院上海细胞库），EGCG（分子量：458.37832，纯度≥99%，购自美国Sigma公司，批号50299），DMEM培养基（Sigma公司，批号D0819），30% H2O2（天津基准化学试剂有限公司，批号20131016），CCK-8試剂盒（广州研创生物技术发展有限公司，批号C0038），Hoechst33258试剂盒（南京碧波生物科技有限公司，批号BA50），Annexin V FITC/PI（美国BD公司，批号556570），Caspase-3、Caspase-9试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号G015、G018）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 H9C2细胞培养在100 μg/mL链霉素及100 U/mL青霉素的DMEM培养基中，内含15%胎牛血清，培养箱温度为37℃。
1.2.2 实验分组 H9C2细胞接种于96孔板后进行分组。①阴性对照组：以正常培养液培养；②H2O2损伤组：将培养融合状态达到80%的H9C2细胞每孔加入100 μmol/L H2O2作用12 h；③EGCG低浓度组：10 μmol/L EGCG孵育24 h后，加入H2O2作用12 h；④EGCG高浓度组：100 μmol/L EGCG孵育24 h后，加入H2O2作用12 h。
1.2.3 CCK-8法测定细胞活力 H9C2细胞培养于96孔板中，随机分为4组。细胞接种于96孔板（细胞密度5×104/mL，每孔120 μL），按上述分组方法培养细胞，培养结束后弃培养液，PBS冲洗细胞，每个培养孔按1∶10比例加入CCK-8液，孵育4 h，酶标仪测定492 nm的吸光度值。每组设3复孔，取平均值。
1.2.4 Hoechst33258核染色检测细胞凋亡 各组H9C2细胞六孔板内培养，经过相应处理后，PBS冲洗3次并在空气中干燥，每孔加入5 g/L的Hoechst33258染色液1 mL，室温下于暗室内固定20 min，吸掉染色液后空气中干燥，于倒置显微镜下观察并记录细胞形态（400×）。活细胞呈均匀淡蓝色荧光，凋亡细胞的细胞核内染色质浓缩，荧光显微镜下可见浓染致密的颗粒状荧光，呈亮蓝色荧光。
1.2.5 Annexin V-FITC染色流式细胞技术细胞凋亡检测 各组H9C2细胞六孔板内培养，经过相应处理后，用0.1%胰酶消化后制备细胞悬液。1000 r/min离心（离心半径500 mm） 20 min后收集细胞，用Annexin V-FITC试剂盒中binding buffer悬浮细胞，调节细胞浓度为5×104/mL，分别加入Annexin和PI，混匀后用流式细胞仪检测细胞凋亡，以上操作均在暗室内避光进行。
1.2.6 Caspase活性检测 胰酶消化后收集细胞，1200 r/min离心（离心半径500 mm）10 min，PBS冲洗2次后加入30 μL细胞裂解液，置于冰上低温孵育20 min，3000 r/min离心10 min，按试剂盒说明书，进行Caspase活性检测。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 EGCG对H9C2细胞存活率的影响
通过用CCK-8法进行EGCG对H9C2细胞活性分析，发现H2O2损伤组H9C2细胞经氧化损伤处理后，细胞存活率明显下降，加入10 μmol/L及100 μmol/L的EGCG后细胞存活率分别提高到66.68%和78.63%，与H2O2损伤组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。
2.2 EGCG对H2O2诱导H9C2细胞凋亡的影响
Hoechst33258染色法是一种检查凋亡细胞数量的形态学染色方法，阴性对照组见正常细胞核呈均匀的蓝黑色弥散低荧光，未见明显凋亡染色的细胞核，H2O2损伤组见散在的亮蓝色类圆形高荧光，为凋亡的细胞核；给予10 μmol/L及100 μmol/L的EGCG作用后，亮蓝色细胞核数量减少，证明凋亡细胞数量逐渐减少。见图1（封三）。
2.3 EGCG对H9C2细胞凋亡的抑制作用
流式细胞技术结果显示，H2O2诱导H9C2细胞发生凋亡，H2O2损伤组细胞凋亡率显著高于阴性对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。结果表明H2O2可以导致H9C2细胞凋亡的发生，经10 μmol/L及100 μmol/L EGCG处理后，其凋亡率分别下降至（23.23±3.29）%和（16.23±1.94）%，与H2O2损伤组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。
2.4 EGCG对H9C2细胞内Caspase-3、Caspase-9活性的影响
H2O2可以诱导H9C2细胞内Caspase-3、Caspase-9表达增加，EGCG能够有效抑制H9C2细胞内Caspase-3、Caspase-9的表达，进而抑制凋亡反应的发生。经10 μmol/L及100 μmol/L EGCG处理后，H9C2细胞内Caspase-3及Caspase-9活性均下降，与H2O2损伤组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。
3 讨论
细胞的氧化损伤与凋亡反应互相影响，互相关联[7-8]。当体内活性氧升高并打破机体平衡时，大量生成的自由基对机体细胞产生毒性作用，诱导细胞凋亡[9-10]。大量证据表明，氧化应激损伤与多种心血管疾病的发生密切相关[11-13]。过量的活性氧可直接攻击细胞膜及细胞器影响细胞的正常生理功能。
CCK-8法是一种常用的检测细胞生长存活的方法。本研究利用100 μmol/L H2O2建立细胞氧化损伤模型，检测结果显示，H2O2 可以引起H9C2细胞存活率下降，EGCG能够剂量依赖性的抑制H2O2诱导的细胞损伤。Hoechst33258核染色法是一种快速简单的检测贴壁生长细胞的凋亡染色方法，正常未发生凋亡的细胞核呈均匀的蓝黑色弥散低荧光，凋亡细胞的胞膜通透性发生改变，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状高荧光。本实验中的凋亡染色结果同样表明，EGCG有效抑制了H2O2诱导的凋亡反应的发生。流式细胞技术通过定量分析凋亡细胞比例检测细胞凋亡率，本实验中的流式细胞技术进一步验证了CCK-8及Hoechst33258核染色法结果。
EGCG天然无毒，其抗氧化活性是维生素E的20倍，使其具有了较强的药用价值，将其作为药物应用于人体，具有很高的安全性[14-15]。国内外大量研究已经证实EGCG在清除体内自由基、抗炎、抗衰老、抑制细胞凋亡方面有一定作用[16-17]。本实验的研究结果进一步证实了EGCG对H9C2细胞氧化损伤的保护作用。
细胞代谢过程中会不断生成氧化代谢产物，当细胞活性下降或者细胞功能受损时，氧化代谢产物会在细胞内聚集进一步引起细胞结构破坏。这些积累性氧化损伤是导致的心肌细胞凋亡是心肌病变发生的一个重要原因[18]。细胞凋亡由Caspase家族的蛋白酶介导，对维持生物体内环境的稳定发挥重要作用。Caspase-3和Caspase-9是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶[19-20]。本研究结果显示，100 μmol/L H2O2作用于H9C2细胞后，Caspase-3及Caspase-9的表达量均明显上升，EGCG有效抑制了Caspase-3及Caspase-9的表达，提示EGCG可能通过减少凋亡因子的表达发挥细胞保护作用。
综上所述，EGCG可在体外发挥较好的抗心肌细胞氧化损伤所导致的凋亡作用，并且能通过调控凋亡相关蛋白来保护心肌细胞。
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（收稿日期：2017-05-17 本文編辑：李岳泽）
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