国家综合实力的提高取决于科学技术的进步,要实现这一目标就需要大量创新型人才。作为人才培养基地的高校,重视学生综合素质提高和创新能力的培养,实验教学体系的建立是实现此目标的有效途径之一。生物技术专业本科生通过在微基因药物实验室的开放实验,了解从上游基因构建→工程菌的筛选与发酵→蛋白质分离、纯化与性质鉴定→生物学活性检验(药效学实验)的基因工程药物的基本研究过程[1],学习了如何设计和构建基因工程菌,掌握了PCR技术,参与了菌种的保管与归档等工作,实验操作技能得到提高,培养了严谨、科学的工作态度,激发了学生的学习积极性和创新意识,为探索有效的实验教学体系积累了经验,现将在微基因药物实验室进行开放性实验过程中的体会总结如下:
学习和掌握微基因药物实验室基本操作技能
1.利用PCR技术获取目标基因
PCR技术,即多聚酶链反应(polymerase chain reaction), 是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mulis在1985年发明的一种体外快速扩增目标DNA的方法。主要有三个基本步骤:
A.双链DNA高温变性解开成单链:加热到94℃,10min。
B.DNA半保留复制:变性、复性、延伸。具体为94℃、1min,55-60℃、1min,72℃、1.5min;25-30个循环
C.DNA链的延伸:72℃,10min。
2.载体
载体用于目的基因插入或克隆,并且有传递、运输外源DNA导入宿主细胞的能力。实验室里常用的载体主要有两类,分别为(1)能使外源基因在宿主细胞中转录和表达的表达载体(如pKK233-2、pET28-a、pED等)和(2)用于繁殖DNA片段的克隆载体(如pBR322、pUA118、pUA119等)[2]。
3.宿主菌
宿主菌用来接收携有目标基因的外源载体,繁殖载体或用来表达目标基因编码蛋白的细胞,有原核系统的大肠杆菌,如BL21、JM105、JM107、DH5等[3],也有用于真核表达系统的毕氏酵母等。
4.基因工程相关的酶
(1)限制性核酸内切酶:是一类能够识别和切割某种特定核苷酸序列的水解酶,实验室常用的限制性核酸内切酶有HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ等。
(2)DNA连接酶:它是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离得到,其功能是催化具有5"-磷酸基与3"-羟基末端形成3",5"-磷酸二酯键。
(3)DNA聚合酶:其功能是以DNA为模板,在引物、底物等条件下,以碱基互补原则合成新DNA链,本实验室内常用的DNA聚合酶来自水生嗜热菌,称为TaqDNA聚合酶;另外一种常用的DNA聚合酶是PfuDNA聚合酶,由于它有3"→5"外切酶活性,能够修复错配的碱基,是目前保真度最高的DNA聚合酶。
参与实验室工程菌菌种的管理
1.菌种保存方法
(1)传代培养保藏法:利用琼脂平板或斜面培养,培养后于4—6℃冰箱内保存,此方法简单易行,但菌种保存时间短,易发生菌种污染。
(2)甘油管保存:生理盐水或LB培养基洗脱琼脂斜面上的菌苔,加入体积为20%的甘油-20℃保存。
(3)牛奶管保存:用脱脂牛奶洗脱培养在琼脂斜面上的菌苔,冷冻干燥后-20℃保存。这种方法是目前微基因药物实验室菌种保存的主要方法。
2.菌种保存时涉及的知识
(1)酶切位点
限制性核酸内切酶水解DNA分子上的特殊核苷酸顺序,实验室里常用如EcoRⅠ切割的位点是G"AATTC、HindⅢ的酶切位点为A"AGCTT等[3]。
(2)选择标记
阳性质粒载体的筛选是通过携带有抗生素抗性基因,实验室中用到的有Kan抗性和Amp抗性,用于重组质粒的检测和筛选标准之一。
(3)制定适用的规范菌种标签:
根据菌种构建和使用过程需要的信息,共制定菌种保管的10个信息点,并制作成标签,放置于每一株菌种袋中。具体内容如下:
体会与收获
1.理解并遵守实验室的规章制度
任何实验室都有其严格的规章制度,开放实验所在的微基因药物实验室同样如此。参加开放实验的同学首先学习实验室规章制度,接受实验室安全教育。遵守实验室各项的管理制度、做到精密仪器使用前的规范操作技能培训、精密仪器预约使用登记和使用仪器运行状况记录等;了解菌种构建人和保存者在储存菌种时每个环节中应该填写的信息,知道应该如何规范地存放菌种等[5]。
2.引进方便实用的计算机管理软件
用word文档处理菌种档案比较麻烦,制作和查找都很不方便。目前开放实验小组成员正在与本实验室研究生以及计算机专业人士合作,尝试用Access、Visual Foxpro 6.0和ASP等高级软件制作成实用的菌种管理系统软件,使得菌种的登记和查找更加方便快捷,具体工作尚在进行之中。
3.参与开放性实验的是生物技术专业二年级学生,对专业知识的了解还不够深入,很多理论知识都是在实验室中边看边学。指导教师在每周的实习工作结束,都会根据此次实习内容布置一些作业供复习领会,将下一周实习工作涉及的知识要点写出来供提前预习,同时列出解决作业中问题需要的参考书籍和下周工作需要参考的相关资料。在每一阶段的工作结束后,指导教师和小组成员都会对开展过的工作进行谈论和总结,同时结合每一段工作讲解一些理论知识。这种结合具体实验内容讲述的理论,便于理解和掌握,也促进了学生在课后的自学的积极性。
4.在指导教师的推荐下,开放实验小组成员阅读了相关书籍和文摘,自学了很多三年级的课程内容。在实验室面对着很多第一手资源,书上的文字和实验室里的所见、平面与立体的这种结合,使学生们对学习充满了兴趣。开放实验小组同学非常乐于接受这种启蒙性的立体教学方式。
5.缺憾
由于大学二年级生物化学、分子生物学、基因工程、生物工程工艺学等专业基础课和专业课都还没有开设,进入实验状态有些慢。另外由于时间短暂,本专业知识的欠缺,很多实验都是观摩实验室研究生的操作,如应用计算机Olige7.0软件设计PCR反应引物、基因工程菌在10立升发酵罐中的发酵等;同样因为时间的原因,开放实验小组成员接触的都是原核生物相关的生物工程技术,而几乎没有时间参与真核生物的相关技术的操作,争取在以后的创新性实验中再学习。
另外参加开放性实验学生住在南京郊区江宁大学城的校区,开放实验所在的微基因药物实验室在南京主城区的玄武门校区,虽然两校区间有班车,但由于两校区相距太远,开放实验又主要利用双休日,实验的开展还是受到一些影响。
结语
大学一、二年级学生往往对本专业开设的课程以及为什么开设这些课程、开设的课程在今后的应用都不是很明确,仅听大学四年级实习的学长说到了实验室才知道开设的许多课的重要性,幸运的是开放性实验让本科生提前进入实验室接触了专业实验,不仅实验技能得到提高,更因为开放实验为低年级学生领会专业课程重要性提供良好平台,激发了学生积极、主动的学习热情和浓厚的科学研究兴趣,为将来的科学探索与创新奠定基础。
[1]曹荣月,欧瑜,卞筱泓.探索生命科学与技术学院本科生专业英语教学新思路[J].中国高等医学教育,2006,113(5):77-79.
[2]Guojun W, Wei G, Kedong O, Yi H, Yanfei X, Qingmei C, Yankai Z, Jie W, Hao F, Taiming L, Jingjing L, Rongyue C. A novel vaccine targeting gastrin-releasing peptide: efficient inhi- bition of breast cancer growth in vivo[J].Endocrine-Related Cancer 2008,15(1):149-159.
[3]曹荣月,申克宇,王学军,凤娇,刘景晶. 重组L-门冬酰胺酶工程菌的表达和PEG的化学修饰[J].生物学杂志,2005,22(6):8-10.
[4]陈庆梅,吴国君,吴洁,李泰明,曹荣月,刘景晶. 热休克蛋白65及其融合蛋白Hsp65-6€譖277的分离纯化和稳定性研究(英文) [J]. 药物生物技术,2007,14(04) 249-254.
[5]刘建成,张丽杰,行鸿彦. 实验式教学管理的问题及对策研究[J]. 实验技术与管理,2008,25 (7) 167-170.
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