牛源性成分核酸检测方法研究进展及技术标准分析

摘 要：牛肉制假、掺假问题严重侵害消费者权益，影响进出口贸易。目前，基于DNA序列特异性以动物物种之间遗传信息的差异作为物种鉴定检测靶标的核酸检测方法已被广泛应用。该文综合论述牛源性成分核酸检测技术的研究进展，并对其发展趋势进行讨论。同时对牛源性成分检测的国内现行技术标准的适用范围、检测方法、检出限等进行详细分析，以供相关执法部门和广大检测工作者参考，为制修订牛源性成分检测技术标准提供理论依据。

关键词：牛源性；核酸；PCR；技术标准

文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2017）12-0050-08

Abstract： Beef fraud， adulteration problems seriously violates the health and interests of the consumers， even influences import and export trade. The nucleic acid detection method based on the DNA sequence specificity that uses genetic information among different animal species as a detection target of species identification has been widely used. This review summarizes the advances in nucleic acid detection techniques available for bovine derived material and discusses the development trend. At the same time， the applicable range， detection method and detection limit of the current China detection standards for bovine derived components were analyzed. In detail for reference by the relevant law enforcement departments and the majority of inspection workers， and lay the foundation for the revision of the technical standards for detection of bovine derived components.

Keywords： bovine derived； nucleic acid； polymerase chain reaction； technical standards

0 引 言

动物源性成分广泛分布于食品、饲料、化妆品等，与人们的生活息息相关，其中食品和饲料所占比例最大。中国是世界上人口最多的国家，也是世界动物源性食品和饲料的生产和消费大国。统计数据显示，2015年，我国牛肉产量达到700万吨[1]。自2004年以来的世界性疯牛病、禽流感、羊搔痒病，以及2013年涉及欧洲l6国的马肉风波等事件曝光以来，肉及肉制品掺假成为世界各国共同关注的热点问题[2]，肉食品及其饲料的安全隐患直接关系到人类的安危[3]。为保护消费者权益，全球不同国家和地区对肉制品的标识要求都做了不同程度的规定。欧盟定量成分声明（quantitative ingredient declaration，QUID）强制要求肉制品需要标识出所有成分及其净含量，详细规定了净含量的计算方法[4]。美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）食品标签指南规定肉制品中需要标识出所有成分，并在食品外包装的主展示面上根据质量按照降序罗列所有成分。《中华人民共和国食品安全法》第六十七条规定，预包装食品的包装上应当有标签，标签应当标明名称、净含量、成分或者配料表等事项。

综上所述，各国已有肉制品标识的法律法规来约束生产者和经营者的行为，但要保障相关法规的有效执行，还需要借助科学精准的检测方法，完善技术标准体系。本文就目前牛源性成分检测的主流技术——核酸检测方法[5]的研究进展进行分析和总结，同时对国内牛源性成分检测现行技术标准状况进行了梳理，并对该领域的未来发展方向进行了探讨。

1 牛源性成分检测方法研究进展

近几十年来，以核酸为标志物的动物种类鉴别检测方法飞速进步，并获得了广泛应用。常用于动物源性成分的核酸检测方法主要包括核酸杂交，聚合酶链式反应（PCR）技术及衍生方法，实时荧光PCR技术，以及近年来发展起来的数字PCR技术，液相芯片技术，DNA条形码技术等。

1.1 核酸杂交技术

早期研究中多用DNA杂交完成动物源性成分鉴定，该方法将用放射性同位素标记的动物全基因组DNA物种特异性探针与固定到尼龙膜上的样品DNA进行杂交，根据产生的放射信号鉴定样品的物种组成。利用这种方法对加工过的牛肉和猪肉的混合制品[6]进行同源性鉴定，得到了良好的效果。但由于方法耗时长、有放射性、对DNA的纯度要求高，探针信号的强度常受到样品组织来源或其加工方式等因素的影响，且灵敏度不高，定量困难，因此在实际应用中受限。

1.2 常规PCR技术

常规PCR技术是相对于荧光定量PCR技术而言的，该技术是核酸检测的基础技术。其突出特点是具有很高的灵敏度，是傳统形态学方法、基于代谢物的检测方法以及基于蛋白的检测方法不可比拟的。这在检测加工牛肉制品和饲料中的牛源性成分时极为重要。该技术不仅可用于分辨动植物种类，也用于动物的品种鉴别和身份识别，并广泛应用于肉类的溯源体系。欧盟、加拿大、澳大利亚等国家都相继建立肉类溯源管理系统。当肉制品发生污染时，对其DNA标记进行检测可以快速地追溯到它的亲本和产地等来源信息。此法用于牛源性成分鉴定的目的基因通常位于线粒体上，可用于生鲜牛肉和烹煮牛肉等的测定，检出限一般在1%以下，部分见表1。