中药材威灵仙基原的显微鉴别

材料与方法

1.1 仪器与材料

FA2004型电子天平（上海图新电子科技有限公司）;BM2000生物数码显微图像分析系统（合肥诺瑞科学仪器有限公司）;歌能G-100S型超声波清洗仪（深圳市歌能清洗设备有限公司）;JP-100A-2高速多功能粉碎机（上海市久品工贸有限公司）;40、60、80、100、125目标准检验筛（浙江省上虞市道墟张兴纱筛厂）;25.4×76.2 mm载/盖玻片（武汉致诚信达科技开发有限公司）;TS-DI10-L/H型实验室超纯水机（陶氏水处理设备工程有限公司）。

威灵仙药材购于安徽亳州药材市场和淮安市各大药房，共计8个产地，14个批次，具体信息见表1。各药材样品均保存于江苏省特色资源开发与药用重点实验室。无水乙醇（色谱纯，天津基准化学试剂有限公司）;氢氟酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）;藏红T（生物染色剂，国药集团化学试剂有限公司）;固绿FCF（生物染色剂，上海沃凯生物技术有限公司）;盐酸（分析纯，南京奥佳化工有限公司）;二甲苯（分析纯，上海沃凯生物技术有限公司）;中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）;水合氯醛（分析纯，上海展云化工有限公司）。水为笔者所在实验室自制超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 横切面切片 分别取14批威灵仙药材，选取根部大小适中者用15%氢氟酸进行软化24 h，用流水冲洗至中性，切成薄片，放至盛有蒸馏水的培养皿中;挑选切面完整透明且薄厚均匀的切片放入50%乙醇溶液中脱水5 min，用番红染液染色30 min， 移入50%乙醇脱色5 min， 进而转入含1.0～1.5 mmol/L盐酸的70%乙醇中脱色2～3 h;用固绿染液染色1～2 s，再用95%乙醇溶液冲洗掉多余染液，放入无水乙醇中脱色5 min;在二甲苯和无水乙醇溶液（体积比1 ∶ 1）中透化 5 min，在二甲苯中透化5 min，用中性樹胶制片，并在显微镜下观察、拍照并保存图像。

1.2.2 横切面切片条件考察

1.2.2.1 番红染液染色时间 本研究分别考察番红染液染色时间对切片染色效果的影响，结果见表2。由此看出，番红染色的最佳时间为30 min，此条件下染色完成后的切片不同部位颜色区别明显，易观察。

1.2.2.2 固绿染液染色时间 本研究考察固绿染液染色时间对切片染色效果的影响，结果见表3。由此看出，固绿染液染色的最佳时间为1～2 s，此条件下染色完成后的切片不同部位颜色区别明显，易观察。

1.2.2.3 番红染液脱色条件 本研究考察了番红染液脱色时，70%乙醇中的盐酸浓度及脱色时间对切片脱色效果的影响。切片经50%乙醇脱色5 min后，再分别用含有不同浓度盐酸的70%乙醇脱色一定时间，观察脱色效果。由表4可知，切片脱色时的70%乙醇中盐酸浓度为1.0～1.5 mmol/L较适宜。

2 结果与分析

2.1 横切面切片显微特征分析

按照横切面切片显微特征，14份样品的观测结果可明显分为3类，分别编号为A、B、C，见图1。A特征：表皮由1～2列扁平细胞组成，直径约为10～16 μm，细胞外壁增厚约 5 μm，为棕黑色;皮层宽阔，有薄壁细胞14～18层，约占根横切面直径的1/2～2/3，类长方形或扁椭圆形，外皮层细胞略为切向延长，长径约为20～30 μm，排列稀疏，细胞间隙大，内皮层明显，可见凯氏点;韧皮部宽阔，细胞多为颓废状，多位于木质部的凹弧外，腔细狭，壁蜿蜒，外侧是否含有石细胞和纤维束不甚清晰;木质部二原型，有2个凹弧，全部木化，导管为圆形或三轮列状，单个散在或多个成群，排列无规律。B特征：表皮由1～2列细胞紧密排列而成，直径约为12～16 μm，细胞外壁增厚4～10 μm，为棕黑色;皮层较宽，有14～18列细胞，约占根横切面直径的1/2～2/3，均为薄壁细胞，类圆形或椭圆形，从外皮层到内皮层逐渐增大，直径约为14～30 μm，排列紧密，外皮层细胞径向延长，内皮层明显，凯氏带清晰可见;韧皮部窄，外侧是否含有石细胞和纤维束不甚清晰;木质部二原型，导管单个散在或多个成群，木化，排列无规律。C特征：表皮由1～2列细胞排列组成，直径约为淡8～20 μm，外壁增厚约 4～10 μm;皮层宽厚，约占根横切面直径的3/4及以上，有薄壁细胞25～30层，类圆形或椭圆形，直径约为14～24 μm，排列紧密，外侧1～2层细胞壁增厚，外皮层细胞径向延长，内皮层明显，可见凯氏带;韧皮宽，木质部为方形，导管多为单个散在，排列无规律。

3种横切面切片显微特征的主要区别见表5， 按2015年版《药典》，威灵仙3种基原鉴别的显微特征主要包括：威灵仙外皮层细胞切向延长，韧皮部外侧常有纤维束和石细胞。东北铁线莲外皮层细胞径向延长，韧皮部外侧偶有纤维束和石细胞;棉团铁线莲外皮层细胞多径向延长，韧皮部外侧无纤维束和石细胞。结合上述观测结果，根据外皮层细胞延长方向可明确鉴别A为威灵仙，而纤维束和石细胞属于粉末特征，在横切面切片中难以观测，因此难以区分B、C是东北铁线莲还是棉团铁线莲。

2.2 粉末制片

分别取14批威灵仙药材，用粉碎机粉碎过筛。取少量 80～100目样品粉末，放置于载玻片上，加入3～4滴50%水合氯醛后加热透化，制片。放置于显微镜下观察、拍照并保存图像。

2.2.1 粉末制片条件考察 本研究考察了粉末粒径对显微观察的影响。将威灵仙药材粉碎后过筛，取一定目数的粉末制片，观测显微结果，由表6可知，药材粒径选择80～100目。

2.2.2 粉末显微结果 按照粉末显微特征，14份样品的观测结果同样可明显分为3类，分别编号为A、B、C，详见图2。A特征：石细胞较多，单个散在或数个成群，类方形、不规则多角形，胞腔大，孔沟明显;木栓细胞较多，一般成群存在，表面观类椭圆形、三角形、长方形、不规则多角形，木化，断面观类长方形;木纤维较多，主为纤维管胞，长梭形，末端钝圆或稍尖，具缘纹孔口斜裂缝状;韧皮纤维较多，为长梭形，木化;导管主要为具缘纹孔导管，具缘纹孔为椭圆形或斜方形，有的横向延长，亦可见网纹导管;淀粉粒众多，类圆形，脐点点状;表皮细胞为长方形;皮层细胞为长方形;非腺毛约1～6个细胞，基部钝圆，顶部尖。B特征：木栓细胞较多，为细长方形，一般成群存在;石细胞类长椭圆形、长方形，不规则分枝状，壁厚，层纹明显，有的可见孔沟;木纤维较多，主为纤维管胞，长梭形;韧皮纤维较少，木化，为长梭形或纺锤状，壁厚，可见纹孔;导管多见，多为具缘纹孔导管，亦见螺纹导管;非腺毛众多，多为 1～6个细胞组成，基部多弯曲，两头稍尖;淀粉粒较多，多为单个散在，类球形、长圆形或肾形;皮层细胞表面观为椭圆形，断面观为长方形，排列紧密;表皮细胞类长方形。C特征：表皮细胞甚多，长方形，排列紧密;皮层细胞多见，类椭圆形或圆形或方形，排列紧密，一般成群存在，有的与表皮细胞相连，清晰可见;导管较多，成束或散在，主为具缘纹孔导管，亦有网纹及梯纹导管，具缘纹口者较大，多破碎，具缘纹孔互列或并列，排列较紧密，少许纹孔缘不甚清晰，纹孔口长椭圆形或呈现裂缝状，木化或非木化;木纤维多为纤维管胞，具缘纹孔点状，纹孔口斜裂状，孔沟稀疏，局部较密;木栓细胞少许，无韧皮纤维和石细胞。

3种粉末显微特征主要区别见表7，按2015年《药典》鉴别标准中的石细胞与纤维束特征，鉴别A为威灵仙，B为东北铁线莲，C为棉团铁线莲。综合来看，具体鉴别14批中药材威灵仙基原的结果见表8。

3 结论与讨论

横切面显微鉴别是最常用的中药材显微鉴别方法，也是《药典》所采用的中药材威灵仙基原鉴别方法。本研究对中药材威灵仙横切面显微鉴别方法的试验条件进行了优化，结果发现，外皮层细胞延长方向特征非常明显，易于观察，且受试验条件影响很小，用于鉴别威灵仙具有很高的专属性和耐用性。但是，石细胞和纤维束特征难以观察，难以区分东北铁线莲和棉团铁线莲，方法的专属性和耐用性有待提高。同时，横切面显微鉴别方法的观测结果受染色和脱色条件影响很大，使得这一方法操作步骤多，较为繁琐，耗时长。而粉末显微鉴别结果可以很容易地观察到《药典》所描述的石细胞和纤维束特征，且东北铁线莲观察到石细胞数目较多，而《药典》记载的横切面显微鉴别中为偶见，这一结果也符合石细胞和纤维束作为粉末显微特征的认知。这一结果表明，粉末显微用于鉴别棉团铁线莲和东北铁线莲有着很高的专属性。如果结合皮层细胞和木栓细胞特征，粉末显微则能够进一步鉴别威灵仙，实现对中药材威灵仙3种基原的鉴别。与横切面显微鉴别方法相比，粉末鉴别操作简单快速，具有更高的专属性和耐用性，可用于中药材威灵仙3种基原的快速鉴别。若将粉末显微与横切面显微相结合，基于现有《药典》采用的外皮层细胞方向、石细胞和纤维束等显微特征进行威灵仙基原鉴别，则方法的专属性和耐用性会进一步提高。

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