除草剂Atrazine对四膜虫BF5株种群增长的影响

报告建议削减莠去津的用量并于2004年1月1日起生效。欧盟国家则在同一时期或更早时间限制或完全禁止了莠去津的使用。

相对其他国家的控制力度，我国对于莠去津的控制显得较为宽松，根据中国国家标准化管理委员会（SAC） 2005年10月3日发布的G/SPS/N/CHN/88中规定莠去津在苹果和梨中的最大残留限量为200ppb，另在G/SPS/N/CHN/87中规定莠去津在农田灌溉水的限量标准为150ppb。但在最新的生活饮用水国家标准GB 5749-2005中规定莠去津残留应少于2ppb，甚至少于美国的3ppb标准，可见我国已开始关注其潜在的危害性。

2 四膜虫介绍（材料与方法）

隶属于原生动物门、寡膜纲、膜口目、四膜科、四膜虫属。已知有10余种。体长40～60微米，成倒卵形或梨形。口位于腹面前方正中，体表被以纵纤毛带，口后纤毛带一般为2条。胞肛和2个伸缩泡孔均位于细胞后端。无性生殖为横分裂。有性生殖为接合生殖。合子核分裂分化产生新的大小核，两细胞分开、分裂。

世界性分布，主要产自淡水，也有的生活于咸水或温泉中。四膜虫能在无菌的液体培养基中生长繁殖，长期以来用它为材料做了大量营养生长和药物学方面的研究，是真核细胞基因工程研究的理想材料。

2.1 材料

2.1.1 嗜热四膜虫BF5株（ Tetrahymena.thermophila BF5）

嗜热四膜虫BF5株（ T.thermophila BF5）为实验室培養纯化后的四膜虫品系，广泛用于各种实验。实验用四膜虫经实验选用培养液1周以上培养，并保证其在实验所选用培养环境下可正常繁殖后予以使用。

2.1.2 莠去津药液

本次实验所选用的原液为50%莠去津溶液，使用双蒸水稀释至10mg/L与1mg/L两种浓度的实验用液密封保存备用。

2.1.3 四膜虫培养液

实验中可以供选择的培养液和培养基种类很多。主要有如下几种：Singer氏培养液、Elliott氏培养液、（月示）胨培养液、沈锡祺等所用的有机培养液以及实验用四膜虫的原培养液配方，另有固体培养基配方3个。

2.2 方法

2.2.1 相关仪器设备

使用的主要仪器设备如下：

OLYMPUS BH-2型 台式光学显微镜

珠江 LRH-250-G型光照培养箱 广东省医疗器械厂

FA1004型  电子天平 上海天平仪器厂

YXQ602型 电热式蒸汽消毒器 山东新华医疗器械厂

5-50μL、20-200μL、1-5mL移液枪 Therme Electron

200mL三角瓶、10mL及5mL试管、10mL带盖培养管、20及100mL量筒、试管架、各容量烧杯、超净工作台、2mL*24目细胞培养板、100目藻类计数板等

2.2.2 培养液的选择和培养中理化指标的控制

本次实验综合考虑了手头可使用的药品、预实验中四膜虫的生活情况以及培养液的保存情况，最终选用如下培养液作为菌种保存和实验所用培养液。

培养遵循少量——多管独立培养，统一时间转接，正式实验前，菌种在选定培养液中经至少一个完整的种群增长过程。培养温度为26℃±1℃，无光照，PH 7.0左右，每12小时或更短间隔摇匀一次以保证培养液中溶解氧。考虑到四膜虫对氧的需求及较长的培养时间，扩增初期采用10mL试管中加2-3mL培养液的少量多管并列培养的方式，这在一定程度上也可避免在初期种群密度较低时意外混入的杂菌对培养进度的影响。

3 结果与分析

3.1 关于种群的观察数据

于27 ℃恒温培养6小时后开始观察计数，经过约186小时 16次观察计数之后确认实验组种群完全消失，期间数据见附表一。各梯度种群密度变化情况如下图。由于150ppb以上浓度数据量较少，故不单独绘图。

3.2 关于个体差异的观察数据

空白组和50ppb组在前期均存在核交换和结合生殖，空白组更是保持到了稳定期之后仍有核交换，其他各组在实验过程中未发现有性生殖现象。平均个体大小在各组中的差别并不明显，但在同一管内的个体中存在差别，分析为分裂生殖所致。同时，在较高浓度（≥150ppb）的组中以及在趋于衰退的管中，非规则形态的个体以及行动能力低下的个体明显增多。

3.3 来自药物因素的影响分析

其他的实验证明莠去津对呼吸活动主要是线粒体活性有抑制作用，考虑其为药品抑制种群的主要因素。

3.4 来自非药物因素的影响分析

其他因素如温度PH等，特别是pH值和培养液内溶解氧对四膜虫种群的影响也是比较明显的。实验初期发现，在pH值在5以下的培养液中种群难以生长，甚至在短时间内消亡，当pH在6.5-7.5的情况下，四膜虫种群可正常生长。实验周期较长，又无法向管中补充氧气，即使使用容积为10mL的培养管进行5mL以下的培养并间隔一定时间晃动，当种群密度上升到一点数量后，可用肉眼观察到培养液上层接近液面处的密度要大于液体下层，可见其存在一定程度的缺氧。

4 结论

以上的分析和部分推断，对于实验所用的四膜虫菌株，50ppb或以下浓度才是安全的，100ppb是实验所用的四膜虫菌株的耐受极限，超过该值的莠去津浓度会导致种群在48小时左右崩溃。即使莠去津对包括人类在内的温血动物毒性不是相当大，但是作为一种半衰期如此长的化学物质，很难不考虑其慢性毒性和其他不被确定或未知的危害性。相对最新的饮用水标准的2ppb浓度标准，水果（如苹果、梨）中的200ppb，农业灌溉用水的150ppb，乃至粮食作物（如玉米）中的50ppb标准都不算低，从保证食品安全的角度，以及突破农产品贸易中的技术壁垒考虑，都有必要作出更严格的限定。

參考文献：

[1]郭子靖，朴秀英，樊玮，姜辉，王晓军.单嘧磺酯在土壤中的淋溶特性研究[J].农药科学与管理，2011（04）.

[2]张宏军，刘学，沙虎全，张佳，周欣欣.我国除草剂登记使用现状及存在问题[J].杂草科学，2011（01）.

[3]张超，杨红.水、土壤和蔬菜中毒死蜱、甲基毒死蜱残留检测前处理方法[J].农药，2010（05）.

[4]吕品，张岩，李建华，张凤云，陈玉玲.植物细胞活性氧的产生和清除机制[J].生物学教学，2010（02）.

[5]宋倩，梅向东，宁君，袁会珠.除草剂的主要作用靶标及作用机理[J].农药，2008（10）.

[6]Function of the Male-Gamete-Specific Fusion Protein HAP2 in a Seven-Sexed Ciliate[J].Eric S.Cole，Donna Cassidy-Hanley，Jennifer Fricke Pinello，Hong Zeng，Marion Hsueh，Daniel Kolbin，Courtney Ozzello，Thomas Giddings，Mark Winey，Theodore G.Clark.Current Biology，2014（18）.