消痰通腑方对结肠癌肝转移模型小鼠胰岛素生长因子蛋白表达的影响

材料

1.1 动物

30只BALB/c雄性小鼠购自中国科学院国家啮齿类上海实验分中心，动物合格证号：2007000532740，生产许可证号：SCXK（沪）2007-0005，使用许可证号：SYXK（沪）2007-0005，6周龄，体质量18～20 g，SPF级条件下饲养。

1.2 细胞株

小鼠结肠癌CT26购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。维持在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，于37 ℃、5%CO2恒孵箱中培养，用含0.25% tyrosine和0.02%EDTA的磷酸缓冲液收获。用于裸鼠皮下传代，本实验瘤组织为第6代。

1.3 药物

消痰通腑方由制半夏、制南星、制大黄、陈皮、鸡内金等组成，药材购自上海雷允上公司，产地明确。水煎剂经旋转蒸发浓缩，原药材浓度为3.536 g/kg，避光保存于4 ℃备用。

1.4 试剂及仪器

胰岛素生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）及其受体（IGF-ⅠR）、结合蛋白-3（IGFBP-3）抗体购于美国ABI公司，EnVision试剂（HRP/Rabbit） 即用型购于丹麦Dako；Trizol购自基尔顿生物科技（上海）有限公司。医用OB吻合胶购自广州白云医用胶有限公司；反转录试剂购自基尔顿生物科技（上海）有限公司， IMS细胞图像分析系统购自基尔顿生物科技（上海）有限公司；Real-time检测仪购自美国ABI公司。

2 实验方法

2.1 建立小鼠结肠癌组织块盲肠原位种植转移模型

采用OB胶粘贴法建立小鼠结肠癌CT26盲肠原位移植模型。传代鼠腋下剥取肿瘤，剔除纤维包膜，切开选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，置于生理盐水中，切成直径1.0 mm小块，备用。实验动物术前禁食12 h，0.4%戊巴比妥钠60 mg/kg腹腔麻醉，皮肤消毒，选择右侧正中旁切口进腹，暴露盲肠，选取盲肠表面血供丰富的地方，用1 mL无菌空针头划破盲肠浆膜层，用无齿镊将破损处向内推压，使局部形成凹龛，将瘤块植入凹内，滴1～2滴医用OB生物胶，使其覆盖瘤组织表面，约40 s凝固后将盲肠回纳腹腔，丝线缝合腹膜及皮肤，关腹。整个过程严格遵循无菌操作。

2.2 分组与给药

小鼠试养1周后，将造模成功的小鼠随机分为中药组和模型组，另设空白组为正常对照，每组10只。中药组予3.536 mg/（g·d）消痰通腑方0.4 mL灌胃，每日1次。模型组及空白组灌胃等体积蒸馏水。

2.3 标本采集

分组后每3 d观察小鼠全身状况、运动情况、营养状态、体质量食量变化；逐日观察肿瘤生长情况，以小鼠腹部出现可触及的包块作为成瘤标志。当荷瘤鼠出现明显消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征时，脱颈椎处死解剖，取原位瘤体、肝脏转移处等，所取标本以10%甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE染色，作组织病理学检查及免疫组化检测。

2.4 观察小鼠成瘤及肝脏转移情况

用药4周后立即麻醉处死荷瘤鼠，剖腹，观察小鼠盲肠原位成瘤情况，并肉眼观察其肝脏转移灶大小（以转移灶的长度为其计算单位，多个转移灶时，将各转移灶的长度累加），并完整剥取肿瘤组织及肝脏，剔除纤维包膜，于电子天平上称取瘤质量及肝质量，计算抑瘤率及肝脏指数。抑瘤率（%）=（模型组平均瘤质量-中药组平均瘤质量）/模型组平均瘤质量×100%。肝脏指数=肝脏湿质量/体质量。

2.5 小鼠肝组织中胰岛素生长因子系统表达的测定

运用EnVision法，测定肝组织IGF-Ⅰ、IGFBP-3的表达。结果判定方法：所有切片均在同一光强度、同一放大倍数下进行图像分析，染色阳性物质呈棕黄色颗粒状，位于细胞核内。虽然阳性染色分布不均匀，强度有差别，但只要有明确阳性产物即作为阳性细胞。用鼠标选择棕黄色或棕褐色阳性区域。每张切片均在显微镜（×250）下至少分析4个视野，每组数据至少10个。表达率测定：记录每个视野的阳性面积像素点及OD值。总面积=351 000像素点，阳性面积1个像素点=0.095 µm2，阳性面积=总面积像素点×阳性面积1个像素点。阳性面积×OD值=免疫组化指数，数值的高低代表阳性表达的强弱。

3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行分析，各组数据以—x±s表示，应用两独立样本进行组间比较。组内不同时间点采用方差分析，两两比较采取LCD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 消痰通腑方对小鼠结肠癌瘤块的影响

模型组小鼠在结肠癌完整组织块接种于盲肠10 d左右，腹部开始触及结节型肿块，以后逐渐增大，在后期小鼠消瘦明显，懒动，饮水、进食状况均较差；中药组小鼠整个治疗周期活动、饮食生长状况均较稳定，抑瘤率为52.3%，其瘤质量与模型组比较，差异有统计学意义（P4.2 各组肝转移情况比较

术后4周，模型组小鼠可见明显消瘦，反应迟钝，呈恶液质状态，处死后10只均可见肝转移灶，肝表面转移结节主要分布在肝左叶边缘及肝门部脏面，有的可见数枚结节，有的融合成片，最大肝转移灶长度（各转移灶之和）为1.2 cm。中药组的肝转移率也为100%，但其肝转移灶明显小于模型组，最大肝转移灶长度（各转移灶之和）为0.7 cm，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），同时，肝质量低于模型组，差4.3 消痰通腑方对结肠癌肝转移模型小鼠肝脏组织中胰岛素生长因子I及其受体、结合蛋白-3表达的影响（见表3～表5）

5 讨论

癌瘤的侵袭和转移是造成肿瘤患者死亡的重要原因。肝脏是大肠癌转移的主要靶器官，结直肠癌确诊时已有20%～40%病例发生了肝转移，而治愈性根治术后再发的肝转移率为50%，结直肠癌死亡的患者肝转移率高达45%～71%。降低结肠癌肝转移率对于提高结肠癌5年生存率有着至关重要的意义。肿瘤在远处形成转移灶需经历细胞增殖、血管再生、基质降解、细胞迁移等级联过程外，还要在新的脏器环境中生存和增殖。IGFs系统不仅是细胞周期及有丝分裂的调节因子，影响破坏细胞增殖与凋亡的平衡，而且在肿瘤转移的全过程中起重要的调节作用，与肿瘤的浸润与转移关系密切[4-5]。IGFs是一类结构与胰岛素相似并广泛存在于组织中的多肽，主要由肝脏合成，局部组织细胞如骨髓、脑及多种肿瘤细胞都能产生和分泌。IGFs系统由具有特定功能的配体（IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ）、IGFR和结合蛋白（IGFBPs）组成。目前认为其主要作用由IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR、IGFBP-3调节。①肿瘤转移的先决条件是肿瘤细胞有不断增殖的能力。IGF-Ⅰ与IGF-ⅠR结合后激活MAPK和PI3K/AKT信号通路，促进细胞增殖和抗凋亡。对结直肠癌肝转移患者的肝脏标本进行免疫组化分析发现，肝转移灶的边缘有高浓度的IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR，且靠近肿瘤的正常肝脏也有IGF-ⅠmRNA和蛋白的高表达。体外研究及动物实验表明，IGF-ⅠR单克隆抗体可以降低IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ促肿瘤生长和分化的作用，抑制肿瘤细胞增殖，并导致肿瘤细胞凋亡[6-7]。②转移至靶器官的肿瘤细胞能否继续生存和生长取决于肿瘤细胞的特性和靶器官是否具备适宜肿瘤生存的条件。Wu等[8]把人类结肠癌组织碎片移植到LID小鼠（IGF-Ⅰ减少到正常小鼠的25%）的盲肠，将注射IGF-Ⅰ与生理盐水进行对照研究发现，IGF-Ⅰ明显促进了盲肠原发肿瘤和肝转移瘤的生长；同时肿瘤血管内皮生长因子的表达量和血管丰富的程度都依赖血清IGF-Ⅰ的水平，证实结肠癌细胞对IGF-Ⅰ的反应性，随IGF-Ⅰ浓度的提高而增加。③IGFBP是一组多功能的可溶性蛋白，与IGF有较高的亲和力，其功能主要是作为IGF在循环中的运输蛋白，调节IGF的代谢和清除，调节IGF及其受体的作用。其中产生于干燥的IGFBP-3结合了90%～96%的IGF-Ⅰ及其受体，是主要的结合蛋白[9]。现在认为IGFBP-3作为抑制与IGF受体竞争结合IGF，从而阻断IGF信号通过IGFR转导入细胞核，进而拮抗IGF促进肿瘤细胞增殖的效应，这是其间接作用[10-11]。此外，研究发现IGFBP-3还能通过诱导凋亡、调节癌细胞黏附等机制发挥抗肿瘤效应[12]。从分子生物学角度探讨IGF-Ⅰ/IGF-ⅠR/IGFBP-3变化与恶性肿瘤发生发展的内在联系是目前肿瘤靶向治疗研究的内容之一。

中医学认为，结肠癌多因饮食失节所致，嗜食肥甘厚腻，醇酒炙煿，易困遏脾土，不能为胃行其津液，水谷不归正化，湿浊内生，气机阻滞，精微不能正常布散而发病。湿浊停留体内，湿聚为痰，热炼津为痰，故湿热壅聚则久能生痰，致肠府湿热重滞，气机运化不畅，大肠传导失司，痰热湿浊停聚，热毒内盛代谢产物不能及时排出而蓄积体内，日久形成积块而成痰结。其治疗上以消痰散结、清热通腑为根本治则，消痰通腑方为魏品康教授从痰论治消化道肿瘤核心治则“消痰散结八法”系列之一，以制半夏、制南星为消痰散结之君药，大黄、炒枳实壳清热通腑为臣药，鸡内金、陈皮理气消积、顾护脾胃为佐使，炙甘草调和药性，共奏消痰散结祛除痰结、清热通腑推陈出新之效。

本研究在前期临床基础上探讨消痰通腑方干预结肠癌肝转移的机制，结果发现消痰通腑方中药组抑瘤率52.3%，瘤质量、肝转移灶、肝质量、肝脏指数明显小于模型组（P<0.05），肝组织中IGF-Ⅰ/IGF-ⅠR的蛋白表达均低于模型组（P<0.05），IGFBP-3蛋白表达高于模型组（P<0.05），与空白组比较，差异均无统计学意义（P>0.05），消痰通腑方具有调节结肠癌肝组织中IGF-Ⅰ/IGF-ⅠR/IGFBP-3蛋白表达的作用。推测其可能是通过影响肝组织中IGF-Ⅰ/IGF-ⅠR/IGFBP-3的表达，改变肝脏局部的环境，从而干预结肠癌的肝转移。

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（收稿日期：2012-05-04，编辑：华强）