摘要：为明确2014-2017年福建省多地区羊发生的一种以流稀薄鼻液为主要症状疾病的病原，对该病进行流行病学调查、肿瘤组织切片观察，特异性PCR诊断以及核酸序列分析，结果显示该病在流行病学、临床症状、病理变化、组织病理变化上与国内外已报道的病例表现基本一致，RTPCR鉴定结果为ENTV2，其中7个分离株与ENTV2CHN2（分离于中国）处于同一进化树分支，1个分离株与ENTVSC（分离于中国）、ENTVShaanxi（分离于中国）处于同一进化树分支。说明近几年福建省流行的羊肿瘤病的病原为ENTV2，为福建省加强该病的防治奠定基础。
关键词：山羊；地方性鼻内肿瘤；分子流行病学
中图分类号：S 8553文献标识码：A文章编号：1008-0384（2017）08-837-05
Abstract：The pathogen that caused a disease characterized by thin nasal discharge on goats in Fujian during 2014-2017 was investigated.An epidemiological survey of the disease was conducted with tumor tissue biopsy， specific PCR diagnosis， and nucleic acid sequence analysis. It was found that the disease had basically the sam eepidemiology， clinical symptoms， pathology， and histopathology as the similar cases reported domestically and abroad. RTPCR identified the pathogen to be ENTV2 Among the various isolated viruses， 7 were in the same phylogenetic tree branch as ENTV2 CHN2， and one in the branch as ENTVSC and ENTVShaanxi， which were all isolated in China.The results confirmed ENTV2 to be the culprit of the disease in goats found in Fujian Province. Hopefully，with the information，a prevention measure and/or cure for the disease could be developed in the near future.
Key words：goat； enzootic nasal tumor； molecular epidemiology
羊地方性鼻内肿瘤（Enzootic nasal tumor，ENT）也称为羊地方性鼻内腺癌（Enzootie nasal adenocarcinoma，ENA） 是一种慢性、接触性疫病，临床症状表现为流鼻液、面部肿胀、打喷嚏、体重减轻，剖检可见鼻腔内一侧或两侧肿瘤（类似菜花状赘生物）[1]。该病由绵羊鼻内肿瘤病毒（enzootic nasal tumor virus of sheep，ENTV1）和山羊鼻内肿瘤病毒（enzootic nasal tumor virus of goats，ENTV2）引起[2-3]。ENTV以上呼吸道上皮细胞为靶细胞诱发鼻腺癌[4]。该病在日本、意大利、加拿大、美国等多个国家均有发生[4-8]，给养羊业造成了严重的经济损失。1995年，在我国内蒙古有该病的报道[9]，近几年，湖南、四川也有该病的报道[10-11]。目前尚未找到合适的ENTV体外培养体系，阻碍了该病毒的致瘤机制和免疫特性等研究。近三年来，福建省多个地區发生了一种羊以流稀薄鼻液、呼吸困难、消瘦为主要症状的疾病，病原未知，无有效的防治方法。本研究旨在对福建省发生的上述羊病进行流行病学调查及分子生物学研究，明确福建省近3年发生的上述羊病的病原，为该病的防控研究提供支持。
1材料与方法
11材料
111病料
采集福建省福州、宁德、南平、三明、莆田、龙岩、泉州等地共47份疑似羊地方性鼻内肿瘤病例的鼻液和鼻内赘生物。
112主要试剂
琼脂糖、PBS和50×TAE（上海生工生物工程有限公司）；Promega反转录试剂盒、DuRed染料（泛博生化）；premix Taq和DNA Marker DL2000（大连宝生物有限公司）。
12方法
121流行病学调查
2015年4月-2017年5月对福建省80份病例进行流行病学调查，其中福州56例、宁德7例、南平3例、三明4例、莆田2例、龙岩3例、泉州5例。调查内容包括发病时间、发病区域、发病品种、发病日龄、发病率、死亡率、临床症状、剖检病变、用药情况等。
122RNA的提取
采取47份一定量检样（鼻内肿瘤赘生物及鼻腔分泌物）分别放入研钵，加入5 mL pH72的PBS进行研磨，研磨后5 000 r·min-1离心5 min，取上清200 μL。用病毒DNA/RNA试剂盒进行RNA提取。
123RTPCR检测以及pol部分基因克隆测序
提取的RNA反转录成cDNA，RNA反转录体系：RNA 2 μL、Oligo（dT） 1 μL、Random Primers 1 μL、5×Reaction Buffer 4 μL、Mgcl2 2 μL、dNTP PCR Mix 1 μL、RNA酶抑制剂05 μL、RT 1 μL、Free Water75 μL，体系为20 μL。反应程序为42℃15 min，70℃15 min。以cDNA为模板，用ENTV2特异性引物进行PCR扩增[12]。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。经过PCR鉴定为阳性的共45个产物，取其中8个分离株（分别命名为ENTV2FJ1、ENTV2FJ2、ENTV2FJ3、ENTV2FJ5、 ENTV2FJ7、 ENTV2FJ8、ENTV2FJ10、ENTV2FJ11），将其PCR扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行克隆测序。
124ENTV pol基因序列相似性分析及进化树分析
用DNAStar软件中的MegAlign对测定序列与羊鼻内肿瘤病毒2型美国分离株（ENTV2UK/ AY1975482）、羊鼻内肿瘤病毒2型SC分离株（ENTVSC /HM1041741）、羊鼻内肿瘤病毒2型Shaanxi分离株（ENTVShaanxi/ KU1791921）、羊鼻内肿瘤病毒2型CHN2分离株（ENTV2CHN2/ KU2588711）、绵羊肺腺瘤病毒（JSRV/ DQ8384941）、内源性绵羊肺腺瘤病毒（enJSRV1/EF6803111）、羊鼻内肿瘤病毒1型NA1分离株（ENTV1NA1/ GU2923171）等病毒的基因进行相似性分析并构建系统进化树。
125鼻内肿瘤病理切片的制作
将鼻内肿瘤组织块置于10%甲醛固定液中固定24 h，流水冲洗24 h，经逐级递增梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，制成石蜡切片，切片脱蜡、入水，苏木精伊红染色（H. E染色），封片，光学显微镜观察组织形态。
2结果与分析
21流行病学调查结果
211流行病学
近年来，该病在福建省内呈现逐渐增多的趋势，从收集的病例来看，福州、宁德、南平、三明、莆田、龙岩、泉州等地区均有该病的发生，约占病例总数的10%～20%，发病品种均为山羊，3月龄至4岁均可发病，其中以1～2岁居多。羊群多呈零星发病，个体发病率为5%～40%，致死率达100%。在羊群里具有明显的传染性，但传播速度较慢，病程大多数持续1～4个月，个别的长达1年；该病一年四季均可发病，以冬春寒冷季节病症更明显。据调查多数羊群发病是由于从外地引种所致。母羊发生该病时，相应的哺乳羔羊都发病。
212临床症状
病羊精神沉郁、行动迟缓、被毛粗乱、逐渐消瘦，体温无明显升高。主要表现鼻流大量稀薄的黏液（图1）、后期流出鲜血，在天气寒冷时流鼻液更为明显。鼻孔周围附着鼻痂，有时可见嘴巴流白沫。病羊出现严重的呼吸困难或鼻塞音，个别出现张口呼吸。额骨变薄、颌面局部形成凹陷或突出，手触之较软，羊角松动、单侧（多为左侧）眼球突出。有些病羊出现视力减退或丧失，走路易摔倒。用青霉素类、氨基糖苷类、头孢类、氯霉素类、磺胺类药物等抗生素治疗无明显疗效，或者病情反复。最后病羊呼吸极度困难，食欲废绝，极度消瘦、衰竭死亡。
213病理变化
本病的病变主要特征在上呼吸道及头骨。鼻甲骨出血严重，筛骨萎缩。鼻腔中出现1个起源于筛骨迷路粘膜的腺瘤，长度2～10 cm，呈菜花状、结节状或类圆柱状，周围无包膜，外观呈粉红色或浅黄色、表面不平、质地较软较脆、切开腺瘤呈均匀的肉色。肿瘤可沿鼻腔生长、压迫筛骨和筛骨迷路、也压迫鼻甲骨和眼球。鼻甲骨、筛骨、蝶骨、额骨不同程度地变软，额窦内有积液或胶冻样渗出物（图2）。有的病羊在额骨上有凹陷或形成粘液囊突出。个别病例在喉头、气管有不同程度的充血和出血。其他内脏器官无明显的肉眼病变。
23基因序列相似性分析及进化树分析
ENTV pol基因序列测序结果上传至NCBI，ENTV2FJ1、ENTV2FJ2、ENTV2FJ3、ENTV2FJ5、 ENTV2FJ7、ENTV2FJ8、ENTV2FJ10、ENTV2FJ11这8个分离株的登录号分别为MF033070、MF033071、MF033072、MF033073、MF033074、MF033077、MF033075、MF033076，相似性分析结果（图4）显示，除了ENTV2FJ3，其他株的pol基因的序列与羊鼻内肿瘤病毒2型CHN2分离株（ENTV2CHN2）序列相似性都在97%以上，ENTV2FJ3的pol基因的序列与羊鼻内肿瘤病毒2型SC分离株（ENTVSC）和羊鼻内肿瘤病毒2型Shaanxi分离株（ENTVShaanxi）pol基因的序列相似性分别为923%和925%。系统进化树结果（图5）显示，ENTV2FJ1、ENTV2FJ2、ENTV2FJ5、 ENTV2FJ7、ENTV2FJ8、ENTV2FJ10、ENTV2FJ11与羊鼻内肿瘤病毒2型CHN2分离株（ENTV2CHN2）处于同一进化树分支，ENTV2FJ3与羊鼻内肿瘤病毒2型SC分离株（ENTVSC）、羊鼻内肿瘤病毒2型Shaanxi分离株（ENTVShaanxi）处于同一进化树分支。
24病理组织学结果
瘤细胞围成大小不等，形状不一，排列不规则的腺泡、腺管或乳头状突起，瘤组织腺泡的大小不一，形状较不规则，局部有散在的红细胞，并有大量的淋巴和单核细胞浸润，为低度恶性的腺癌（图6）。
3讨论
本研究对发生在福建省类似羊地方性鼻内肿瘤的病例进行了流行病学调查、临床症状的观察、剖检、组织切片观察及PCR鉴定，结果显示该病在流行病学、临床症状、病理变化、组织病理变化上与国内外已报道的病例表现基本一致[1，7-8]，RTPCR鉴定结果为ENTV2，进化树分析结果显示有7个分离株与ENTV2CHN2（分离于中国）处于同一进化树分支。说明近几年福建省流行的羊肿瘤病的病原为ENTV2，与ENTV2国内株有着较近的亲缘关系。
ENT在临床上出现的流鼻液、喷嚏、呼吸困难与鼻塞音等呼吸道症状，与羊支原体肺炎和山羊传染性胸膜肺炎相似，而且在本次调查研究中发现临床上有羊地方性鼻内肿瘤与羊支原体肺炎并发的现象，临床上常把ENT的病例当作支原体性肺炎病例治疗。羊支原体性肺炎病例剖检有肺的病变肺肝样病变，而ENT的病变主要集中于头骨（鼻甲骨和筛骨），除了部分病例有气管充血和出血外，其他内脏器官基本无明显病变，这是主要的区别特征。
ENTV能导致机体产生免疫抑制[13-15]，而且目前尚未找到合适的ENTV体外培养体系，限制了羊地方性鼻内肿瘤病毒免疫学的研究。目前没有疫苗防治该病，抗生素治疗无效，只能通过严格检疫引进的羊群和淘汰感染和带毒的羊群来消灭该病，以此来净化羊群。ENT病程长，致死率高达100%，且在福建省呈现蔓延的趋势，给福建省羊养殖业造成了重大的经济损失。当务之急，需尽快研制出能控制该病蔓延或者净化该病的方法，以减少该病对福建省及我国养羊业的危害。另外，迫切需要研发适于ENTV體外增殖的培养体系，为ENTV病原学、致病机制、免疫学以及疫苗等的研究奠定基础。
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（責任编辑：张梅）
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