摘要：为了筛选对雏鸡腹泻具有显著预防作用的芽孢益生菌，采用琼脂平板扩散法，以大肠杆菌菌株为病源指示菌，从健康鸡肠道中筛选到1株具有较强抑菌活性的拮抗细菌JM-42菌株，对该菌株进行形态学、生理生化、16S rDNA 序列分析，同时采用有机溶剂萃取和盐析法对其代谢产物进行提取，对其产物物质种类及性质进行分析。结果表明，JM-42菌株与标准菌株Bacillus velezensis的同源性最高，为99.92%，且二者在所构建的系统发育树上的同一分支上，最终鉴定JM-42菌株为B. velezensis。通过对其代谢产物进行初步分析得出，其拮抗物质为蛋白质，50%硫酸铵盐析所得到的蛋白质组分活性最强，且对热及酸碱敏感性较弱，性质比较稳定。
关键词：鸡；芽孢益生菌；筛选；鉴定；抗菌蛋白
中图分类号：S852.6 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2014）08-0208-04
益生菌是指通过摄取适当的量，能够起到有效作用的活菌，它是通过调节肠道微生物生态平衡，改善肠道防御功能、维护肠道屏障功能的微生态制剂[1-2]。目前，欧盟等国家均出台了相应政策、法律来严格限制甚至禁止抗生素的使用，作为抗生素功能的替代品，微生态制剂以其无污染、无残留、促生长并具有提高免疫力、促消化的功能而受到人们的关注。芽孢杆菌可以形成芽孢的兼性厌氧菌，具有很强的抗逆性，而且还可以产生多种消化酶及维生素等营养物质[3]，且芽孢细菌后期的规模化生产可操作性强，易于推广应用，因此成为目前微生态制剂的首选菌种。幼龄动物由于生长发育不完全，易受到环境、饲料、疾病的影响，导致一些消化道疾病，为了保证益生菌进入机体内的活性及定植，本试验从健康鸡肠道中筛选对致病性大肠杆菌有显著拮抗作用的芽孢菌株，并对其抑菌物质进行初步分析，为鸡源芽孢益生菌的后期研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
致病性大肠杆菌，由河北农业大学生命科学学院制药工程系实验室保存。
1.2 样品采集
新鲜的健康鸡肠道，取自河北省清苑县某肉鸡养殖场。
1.3 培养基
细菌用培养基包括NA培养基、NB培养基[4]；
生理生化鉴定用培养基依据鉴定手册中的方法[5]进行配制。
1.4 试验方法
1.4.1 鸡源芽孢杆菌的分离
从健康鸡新鲜盲肠中取1 g内容物，溶于10 mL无菌水中，80 ℃水浴灭菌20 min。用无菌水10倍梯度稀释，取适当稀释梯度的悬液在平板上涂布，每个稀释度涂布3个平板，37 ℃恒温箱培养24 h，获得单菌落。挑取不同形态单菌落转接到NA培养基斜面上纯培养，每个平板划4个菌，编号，记录。
1.4.2 鸡源芽孢杆菌的初筛和复筛
将不同菌落分别转接到含大肠杆菌的病原菌平板上，与大肠杆菌对峙生长，置于37 ℃恒温培养24 h。观察是否有抑菌圈出现，进而挑选出形成抑菌圈的菌株，置于-4 ℃冰箱保存备用。
从初筛的拮抗细菌中选出抑菌活性较高的菌进行复筛。将挑选出来的菌株，以NA培养基活化后，接种于NB培养基中，37 ℃、180 r/min摇床培养48 h后，取用0.2 μm微孔滤膜过滤除菌的拮抗细菌发酵液约15 μL，37 ℃培养24 h，测量并记录抑菌圈直径。
1.4.3 鸡源芽孢杆菌JM-42菌株的种属鉴定
根据菌株的菌落形态特征、菌体形态特征、革兰氏染色性状、芽孢染色性状、有关生理生化鉴别试验，参照文献[5]与《伯杰氏细菌鉴定手册》进行属和种的鉴定。
1.4.4 鸡源芽孢杆菌JM-42菌株的生理生化鉴定
按照相应属、种鉴定的有关内容进行生理生化鉴定。试验要求分别进行接触酶试验、H2S产生试验、吲哚试验、明胶液化试验、氨基酸脱羧酶试验、淀粉水解、V-P试验、M.R试验、柠檬酸盐利用和糖、醇发酵等。
1.4.5 鸡源芽孢杆菌JM-42菌株的16S rDNA的鉴定
1.4.5.1 鸡源芽孢杆菌JM-42菌株基因组DNA的提取及其PCR扩增和序列测定
取对数生长期菌株的发酵液（培养4～12 h）750 μL至EP管中，4 ℃下10 000 r/min离心 10 min，重复3次。用无菌水振荡洗沉淀2次（洗残留的发酵液），4 ℃下10 000 r/min离心10 min。加400 μL TE（Tris-HCl和EDTA混合液）溶解沉淀。液面下加入20 μL溶菌酶（50 mg/mL），轻轻摇匀混合，置于37 ℃温育过夜，间歇摇动EP管，加400 μL CTAB，65 ℃水浴40 min。冷却至室温，加入400 μL酚-三氯甲烷（1 ∶1），轻轻混匀，4 ℃下12 000 r/min离心10 min。移取上清，加入350 μL三氯甲烷，轻轻混匀，4 ℃ 下12 000 r/min 离心10 min。取上清，加入等体积冰冻异丙醇，轻轻摇匀，置于-20 ℃冰箱 1～4 h，沉淀DNA。取出后，12 000 r/min 离心10 min。沉淀以75%乙醇洗2次，风干（至完全去除乙醇气味），得到DNA粗品。
纯化DNA：加入200 μL TE溶解沉淀，液面下加入RNA酶（20 mg/mL），37 ℃保温30 min。加入400 μL 酚-三氯甲烷（1 ∶1），轻轻混匀，4 ℃下12 000 r/min离心10 min。移取上清，加入350 μL三氯甲烷，轻轻混匀，4 ℃下12 000 r/min离心10 min。取上清，加入1/10体积的2 mol/L KAc溶液和2倍体积的无水乙醇，置于-20 ℃保藏1～12 h。取出，4 ℃下 10 000 r/min 离心10 min。用75%乙醇洗2次，风干。加 20～30 μL TE溶解沉淀，于-20 ℃保藏。
凡是离心后吸取上清液的步骤，必须使用处理过的枪头。剪去枪尖2 mm左右，目的是减少对DNA片段的剪切力，提高收率。
JM-42的基因组DNA扩增引物为细菌的16S rDNA通用引物，正向引物PrimerA：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物PrimerB：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR扩增的条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸90 s，共32个循环；72 ℃延伸 10 min。得到的PCR产物经试剂盒纯化后，送往上海生物工程技术服务有限公司测序。
1.4.5.2 鸡源芽孢杆菌JM-42菌株16S rDNA序列分析及系统发育树绘制
利用BLAST方式将测定好的JM-42菌株的16S rDNA序列与GenBank中所有已测定的芽孢杆菌属16S rDNA基因序列进行同源序列分析比对，选取序列相似性高的菌株用ClustaX 1.8软件对比序列的相似性，并利用Neighbor-Joining法构建系统发育树。
1.4.6 鸡源芽孢杆菌JM-42菌株的产物性质分析
1.4.6.1 溶剂萃取
将JM-42菌株活化后用NB培养基进行静置液体发酵。取48 h发酵液4份，每份100 mL，离心后分别用1/3体积的三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液在通风处内自然挥发至干燥，分别用5.0 mL蒸馏水溶解后，用琼脂打孔扩散法在病原菌平板上测定抗菌活性，在同一平板上同时测定发酵液、萃余液的抗菌活性，并以蒸馏水作为阴性对照、发酵液作阳性对照。
1.4.6.2 硫酸铵盐析
取48 h发酵液200 mL，离心后在不断搅拌情况下缓慢添加硫酸铵30%、60%、80%饱和度，于 4 ℃ 冰箱沉淀过夜，10 000 r/min离心10 min得沉淀，加 0.01 mol/L Tris-HCl（pH值7.4）缓冲液溶解，透析，冻干。用0.01 mol/L Tris-HCl（pH值7.4），经0.22 μm微孔滤膜过滤，制成10 mg/mL抗菌物溶液，用于拮抗活性测定。用琼脂打孔扩散法在病原菌平板上测定透析液抗菌活性，在同一平板上同时作蒸馏水阴性对照和发酵液阳性对照。
1.4.6.3 粗蛋白稳定性研究
将粗提拮抗蛋白用无菌水配成浓度为10 mg/mL的溶液。分别测定粗蛋白对热、pH值的稳定性和对胰蛋白酶的敏感性，从而初步判断抗菌物质的稳定性。
粗蛋白热稳定性的测定：将拮抗蛋白的粗提取液分别在40、60、80、100 ℃以及0.1 MPa、121 ℃各处理20 min，然后进行抑菌活性的测定。以常温处理的蛋白液作对照，25 ℃培养2 d后观察抑菌结果，并测量抑菌圈直径，比较分析结果。
粗蛋白pH值稳定性的测定：将拮抗蛋白的粗提液与磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液等体积混合，再用0.01 mol/L盐酸或氢氧化钠分别调pH值至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0进行抑菌活性的测定，25 ℃培养2 d后观察抑菌结果，以琼脂打孔扩散法，观察不同pH值发酵液的抑菌效果，比较分析结果。
粗蛋白对胰蛋白酶的敏感性：将抗菌粗蛋白提取液分装于Ep管中，1 ∶1加入2 mg/mL胰蛋白酶溶液，以加无菌水的发酵上清液作对照，用琼脂打孔扩散法，在病原菌平板上选择合适的间距打孔，作3个平行，在37 ℃恒温孵育0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，观察经胰蛋白酶处理不同时间的抗菌粗蛋白的抑菌效果，测量抑菌圈直径作记录。以上各处理和对照分别用抑菌圈法测定其抑菌活性。
2 结果与分析
2.1 拮抗细菌的初筛
将分离得到的不同特征的耐高温单菌落经纯化后分别与大肠杆菌进行对峙生长试验，从初筛的70株拮抗细菌中选出抑菌活性较高的20株菌进行复筛。
2.2 拮抗细菌的复筛
对20株形态不同的活性较高的菌株进行复筛，共分离得到具有较高拮抗作用的菌株5株，其抑菌圈直径均不小于 11 mm（表1），其中菌株JM-42抑菌圈直径为14.2 mm，能有效抑制大肠杆菌的生长。
3 结论与讨论
芽孢益生菌作为微生态制剂的一种重要来源细菌，在维护动物肠道健康、促进微生态平衡等方面发挥着重要的作用。芽孢细菌在逆境环境下形成芽孢，在温度、pH值、营养条件适粗时萌发生长，产生营养物质，发挥其益生作用。但芽孢杆菌在常规动物肠道发挥生理功能，可能是通过与其他微生物相互作用的结果，而非单一的芽孢杆菌在倡导生长代谢造成的[7]。通过拮抗作用来筛选益生菌，是最直接有效的途径[8]。本试验从鸡肠道中筛选出对致病性大肠杆菌具有显著拮抗作用的菌株，经复筛可以确定，JM-42菌株的代谢产物中含有较高的抑菌活性物质，能产生有效的抑菌作用，经形态学、生理生化、16S rDNA序列分析得出鸡源JM-42菌株为Bacillus velezensis。
细菌素是某些细菌产生的具有抗菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物[9]，目前由益生菌中的乳酸菌所产生的细菌素有40余种[10]。益生菌中的乳酸菌在代谢过程中除细菌素外，还能产生乙酸、乳酸及过氧化氢等具有抑菌活性的物质。因此，为了排除这些非细菌素物质的干扰，本研究利用硫酸铵盐析对代谢产物进行粗蛋白的分离，结果发现50%硫酸铵对粗蛋白提取量最大，抑菌效果最明显。因此，证明了JM-42菌株发酵液中提取物的抗菌活性是类细菌素所致，而不是有机酸和过氧化氢所致。
JM-42抗菌蛋白在较广泛的pH范围内都有较好的抑菌活性，酸碱适应性较强；在外界温度为40 ℃时抑菌活性最强，但在40～100 ℃ 下抑菌活性稍有减弱，在121 ℃下明显有所减弱，但在此温度下仍有抑菌圈出现，说明JM-42抗菌蛋白粗提液具有较好的热稳定性。20世纪80年代初，Hultmark等研究在滞育德惜比古天蚕蛹中利用大肠杆菌诱导时发现一类新型的抗菌蛋白，该蛋白分子量在7 ku，不同于溶菌酶的15 ku，与氨基酸组成相似，具有热稳定性[11]，与申吉泓等报道[12]一致。在用胰蛋白酶处理孵育的过程中仍出现抑菌圈，说明该抗菌粗蛋白对胰蛋白酶不敏感。JM-42作为饲料添加剂应用于饲料中，在动物消化道产生的抗菌蛋白不会被胰蛋白酶降解，能发挥其抗菌作用。抗菌肽成分为易消化吸收的氨基酸，可作为畜禽饲料添加剂取代或部分取代目前饲喂动物所用的抗生素，减少抗生素对动物体的危害。目前，利用酵母产生抗菌肽酵母制剂，在预防及治疗仔猪白痢、雏鸡白痢方面有明显效果。总之，该蛋白质性质较稳定，耐热耐酸能力强，对病原细菌有较强的抑制能力，由蛋白类物质或非单一抗菌物质所组成，有关其组分和结构鉴定方面须要进一步研究。本研究结果为益生菌的进一步应用提供技术支持。
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