芍药苷对LPS脑损伤模型小鼠氧化应激和能量代谢的影响

[摘要]该文主要研究芍药苷（paeoniflorin，Pae）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性脑损伤的保护作用。实验中将雄性Bal b/c小鼠随机分为正常组、模型组、芍药苷低及高剂量组4组。腹腔注射生理盐水或Pae（10，30 mg·kg-1）每日1次，连续6 d。第7天除正常对照组，其他组给药1 h后腹腔注射LPS（5 mg·kg-1），建立急性内毒素炎症模型，6 h后制备脑匀浆进行相关指标测定。比色法检测脑组织匀浆中的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢（H2O2）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、Na+-K+-ATP酶以及Ca2+-Mg2+-ATP酶活力;Western blot法检测脑组织中HO-1，Nrf2蛋白表达水平。研究发现芍药苷可降低LPS脑损伤模型小鼠脂质过氧化物MDA水平，提高脑组织中SOD和GSH-Px活性，提高T-AOC，降低H2O2水平;提高SDH、Na+-K+-ATP酶以及Ca2+-Mg2+-ATP酶活力。与对照组相比，LPS模型组小鼠脑组织核内Nrf2蛋白水平轻度上调，诱导HO-1蛋白表达增加，芍药苷可明显激活Nrf2的核转位，并且显著上调HO-1蛋白水平。结果提示芍药苷减轻LPS诱导的小鼠急性炎症脑损伤，可能与其抗氧化作用以及改善能量代谢有关。

[关键词]芍药苷;脑损伤;脂多糖;氧化应激;血红素氧化酶-1

Effect of paeoniflorin on oxidative stress and energy metabolism in mice

with lipopolysaccharide （LPS）-induced brain injury

LIU Ling1*， QIU Xiang-jun1， HE Su-na1， YANG Hui1， WANG Deng1， YANG Xue-mei

（Department of Pharmacy， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China）

[Abstract]Paeoniflorin is the main active ingredient of Chinese herbaceous peony. This study is to investigate the protective effect of paeoniflorin （Pae） on acute brain damage induced by lipopolysaccharide （LPS） in mice. The mice were randomly assigned to the normal control， model control （LPS）， as well as groups of paeoniflorin and lipopolysaccharide （Pae+LPS）. Then the mice were administered intraperitioneally with normal saline or Pae （10， 30 mg·kg-1） once daily for 6 d. One hour after intrapertioneally treatment on the seventh day， each group were injected LPS （5 mg·kg-1） to establish the endotoxin lipopolysaccharide inflammation model except the normal group. The mice were sacrificed after 6 h and the brain homogenates were prepared and measured. The malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， total antioxidant capacity （T-AOC）， hydrogen peroxide（H2O2）， succinatedehydrogenase （SDH）， Na+-K+-ATPase and Ca2+ -Mg2+-ATPase were dectected by the colorimetric method. The levels of HO-1 and Nrf2 protein in subcellular fractions of brain tissue were detected by Western blot. The results demonstrated that the administration with paeoniflorin reduced the levels of the MDA production; significantly increase the activities of antioxidant enzyme （SOD and GSH-PX） .In addition， paeoniflorin could enhance the total antioxidant capacity， decrease the level of H2O2， and increase the activities of SDH， Na+-K+-ATPase and Ca2+ -Mg2+-ATPase. Furthermore， paeoniflorin can increase the expression of HO-1 and activate the nuclear transfer of Nrf2. Taking together， these findings suggest that paeoniflorin alleviate the acute inflammation in mice brain damage induced by LPS， which is related with its antioxidant effect and improvement of energy metabolism.

[Key words]paeoniflorin; brain damage; lipopolysaccharide; oxidative stress; heme oxygenase-1

doi：10.4268/cjcmm20151434

芍药苷是中药芍药的主要有效单体成分，具有降低血液黏度、扩张血管、抗氧化、改善微循环等作用。Cao等发现芍药苷可提高脂多糖（LPS）感染小鼠的存活率，减少肺、肾损伤，减少肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素1β（IL-1β）的释放^[1]。LPS即革兰阴性杆菌细胞壁的主要成分，是一种强力炎性反应诱导剂，可以作为非特异性免疫刺激物质，能通过MAPK或NF-κB信号转导通路及相应转录因子，而介导炎性介质TNF-α，IL-1β等的表达，从而释放NO等大量细胞因子，产生氧化应激和炎症反应^[2]。氧化应激损伤在中枢神经系统疾病中发挥了关键作用，由于自由基的产生超过内源性抗氧化系统的清除能力，从而直接损伤细胞，还可以通过介导线粒体途径、DNA修复酶及转录因子等间接导致细胞凋亡^[3]。Nam等发现芍药苷可抑制LPS引起的海马细胞死亡和NO产物的生成，同时减少小角质细胞NO，TNF-α和IL-1β的释放^[4]。但芍药苷减轻LPS所致中枢神经系统损伤作用是否与其提高机体的抗氧化能力有关，值得进一步探讨。本研究以LPS诱导小鼠建立氧化应激与炎症反应模型，并通过生化检测的方法，选取脑组织匀浆，测定其氧化应激和能量代谢相关指标，从而研究芍药苷对LPS炎症小鼠氧化应激反应的调节机制。

1材料与方法

1.1动物清洁级雄性Bal b/c小鼠，体重22～26 g，由河南科技大学实验动物中心提供。小鼠分笼饲养，自由饮水进食，实验前置实验环境中适应 2～3 d。

1.2试剂LPS购自Sigma公司，芍药苷为西安昊轩生物科技有限公司产品（纯度为98%），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢（H2O2）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、Na+-K+-ATP酶以及Ca2+-Mg2+-ATP酶活力均购自南京建成科技有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，核蛋白和胞质蛋白抽提试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，HO-1，Nrf2，β-actin，Lamin B和二抗Anti-rabbit IgG购于Cell signal Technology公司。其余试剂均为市售分析纯。

1.3实验分组及模型建立^[5]雄性Bal b/c小鼠随机分为对照组、模型组（LPS）、芍药苷低、高剂量组（LPS+Pae）4组。芍药苷组给药剂量分别为10，30 mg·kg-1，给药体积为0.2 mL·10 g-1。正常组及模型组给予等体积生理盐水。每天腹腔注射给药1次，连续给药6 d。第7天除正常对照组外，其余3组小鼠给药1 h后立刻腹腔注射LPS（5 mg·kg-1）制备急性LPS脑损伤模型，6 h后摘眼球取血制备血清、脑匀浆进行相关指标测定。

1.4脑组织各项指标的测定取出脑组织，迅速放入冰盒中，称取脑组织适量放进1.5 mL的离心管中，按体积1∶9加生理盐水于离心管中，用匀浆机搅拌均匀，放入离心机中，4 ℃，3 000 r·min-1，离心10 min，取上清液放入离心管中。再吸取适量的10%脑匀浆，按试剂盒操作步骤测定MDA，SOD，GSH-Px，T-AOC，H2O2，SDH和ATP酶水平。采用BCA试剂盒于562 nm处测定样品蛋白含量。

1.5Western blot检测蛋白表达把组织剪切成细小的碎片。加入适量冰冷的PBS洗涤2次后，离心，弃上清。按照核蛋白和胞质蛋白抽提试剂盒说明书分离核蛋白和胞浆蛋白。然后，采用12%的SDS-PAGE分离蛋白，将蛋白质转移到PVDF膜，5%的脱脂奶粉室温封闭2 h。封闭过的膜用TBST洗涤3次。将膜放入杂交袋中，加入一抗4 ℃孵育过夜，使抗原抗体充分结合。隔天，将膜从杂交袋中取出，用TBST洗涤3次;再放入新杂交袋中，加入二抗体以结合一抗，室温孵育膜2 h。化学发光法检测，用凝胶成像系统拍照成像。目的蛋白的灰度值除以内参β-actin的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

1.6统计学处理应用SPSS11.5统计软件进行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1芍药苷对LPS小鼠脑组织中MDA，SOD和GSH-Px水平的影响与对照组相比，LPS模型组脑组织中脂质过氧化水平MDA含量升高，抗氧化酶SOD和GSH-Px活性降低，提示LPS可引起小鼠脑组织氧化应激水平升高，抗氧化能力下降。与LPS模型组相比，芍药苷可降低小鼠脑组织匀浆中MDA水平，升高SOD和GSH-Px活性，从而提高其抗氧化能力，见图1。

2.2芍药苷对LPS 小鼠脑组织中T-AOC和H2O2水平的影响与对照组相比，LPS模型组脑组织中T-AOC水平降低，而H2O2水平升高，提示在LPS刺激下，脑内抗氧化能力减弱，过氧化物生成增多，进一步验证了氧化应激的产生。与LPS模型组相比，芍药苷可提高脑内的T-AOC水平，减少H2O2的生成，提高脑内抗氧化防御体系，见图2。

2.3芍药苷对LPS小鼠脑组织中能量代谢的影响与对照组相比，LPS模型组脑组织中SDH活性，以及Na+， K+-ATP酶和Ca2+， Mg2+-ATP酶活性显著下降，提示能量代谢通路受损;芍药苷可明显增加脑组织中SDH活性，增加Na+， K+-ATP酶和Ca2+， Mg2+-ATP酶活性，起到改善能量代谢的作用，见图3。

2.4芍药苷对LPS小鼠脑组织中HO-1和Nfr2蛋白表达的影响与对照组相比，LPS模型组小鼠脑组织核内Nrf2蛋白水平轻度上调，诱导HO-1蛋白表达增加;而芍药苷可明显激活Nrf2的核转位，并且显著上调HO-1蛋白水平，见图4。

3讨论

研究表明，在炎症反应过程中会伴有大量自由基产生，包括超氧阴离子、过氧化氢物、氢自由基、NO等，它们会攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而发生脂质过氧化反应，破坏脂肪酸链和细胞膜的完整性，损伤组织中各种细胞。氧化应激是指细胞暴露于高浓度氧分子或氧的化学衍生物而引起的细胞损伤，而自由基作用于生物大分子，破坏细胞结构，最终导致诸如脑缺血、动脉粥样硬化、糖尿病等的发生发展^[6]。

细胞内自由基的清除主要依靠抗氧化酶（如SOD，GSH-Px，CAT等）和非酶抗氧化剂（如GSH，维生素C，维生素E等）。实验结果表明，LPS炎性损伤可使小鼠脑组织中SOD，GSH-Px活性下降，H2O2等活性氧在体内积累，进一步诱导其他自由基的产生，导致脂质过氧化反应，总抗氧化能力下降，脑组织MDA生成量显著增加，造成脑组织的氧化损伤。芍药苷能增加SOD和GSH-Px活性，增加总抗氧化能力，减少H2O2生产，并抑制MDA的生成，从而对LPS小鼠脑组织自由基造成的损伤具有一定保护作用。

线粒体是细胞中能量储存和供给的场所，线粒体功能障碍是导致氧化应激的主要原因，同时也是启动细胞凋亡的关键因素^[7]。SDH主要定位于线粒体内膜，是唯一连接三羧酸循环和呼吸链的关键酶，其活力反映了线粒体的功能。另外，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶对维持细胞的形态与功能十分重要。从某种意义上讲，Na+-K+-ATP酶活性的变化标志着细胞活力和状态的改变，而Ca2+-Mg2+-ATP酶对维持胞内钙浓度有重要的调节作用^[8]。脑内能量代谢障碍时，细胞内ATP逐渐耗竭，做为依靠ATP运转的离子泵，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性因能量障碍而受到抑制，导致胞内Na+和Ca2+超载，造成离子稳态失衡。细胞内Na2+超载，影响了Na+，Ca2+交换体的正常活动，抑制了细胞内Ca2+的外排^[9]，进一步加重了细胞内Ca2+超载，从而激活一系列的蛋白水解酶，引起迟发性细胞死亡。不同浓度芍药苷可不同程度的恢复LPS脑损伤后SDH活力，改善线粒体功能;提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，有利于调节细胞内Ca2+水平及维持线粒体正常的氧化及产能过程，尤其对Na+-K+-ATP酶活性更明显，说明芍药苷对线粒体的氧化及产能功能改善明显。

血红氧合酶-1（heme oxygenase-1， HO-1）是一种重要的抗氧化酶，又称热休克蛋白32（HSP32），在各种理化因素如发热、氧化应激等状态下，可在脑中大量被诱导并表达，从成为预防氧化攻击的首选靶基因之一^[10]。HO-1在正常情况下低表达或不表达，但在应激情况下HO-1适量表达可减轻细胞损伤、蛋白质氧化及脂质过氧化等。核转录因子2/抗氧化反应元件（Nrf2/ARE）通路是抗氧化应激损伤的主要途径，可诱导一系列抗氧化酶产生，以形成强大的抗氧化防御体系，对维持细胞的氧化还原活性，以及在HO-1基因表达调控方面也起到了重要的作用^[11]。实验结果显示，LPS引起小鼠脑损伤时，均能适度上调Nrf-2和HO-1蛋白表达，可能是机体对氧化应激的一种适应性反应。而芍药苷可使上述蛋白表达显著增加，提示芍药苷可能通过激活Nrf2核转位来调节HO-1蛋白表达。

综上所述，芍药苷可减轻LPS引起的小鼠炎性脑损伤的作用，可能与清除体内自由基，提高机体抗氧化能力，抑制脂质过氧化，消除氧化应激，激活Nrf2核转位，上调HO-1有关。

[参考文献]

[1]Cao W， Zhang W， Liu J， et al. Paeoniflorin improves survival in LPS-challenged mice through the suppression of TNF-α and IL-1β release and augmentation of IL-10 production [J]. Int Immunopharmacol， 2011， 11 （2）：172.

[2]Koo H J， Yoon W J， Sohn E H， et al. The analgesic and anti-inflammatory effects of Litsea japonica fruit are mediated via suppression of NF-κB and JNK/p38 MAPK activation[J]. Int Immunopharmacol，2014，22（1）：84.

[3]Zhou W W， Lu S， Su Y J， et al. Decreasing oxidative stress and neuroinflammation with a multifunctional peptide rescues memory deficits in mice with Alzheimer disease [J]. Free Radic Biol Med， 2014， 74：50.

[4]Nam K N， Yae C G， Hong J W， et al. Paeoniflorin， a monoterpene glycoside， attenuates lipopolysaccharide-induced neuronal injury and brain microglial inflammatory response [J]. Biotechnol Lett， 2013， 35 （8）：1183.

[5]张斌， 李红梅， 王媛， 等.芍药苷减轻小鼠LPS性急性肺损伤的作用机制研究[J].中国病理生理杂志，2011，27（10）：1956.

[6]Ladecola C， Alexander M. Cerebral ischemia and inflammation. Curr Opin Neurol， 2001， 14（1）： 89.

[7]Kaur P， Radotra B， Minz R W， et al. Impaired mitochondrial energy metabolism and neuronal apoptotic cell death after chronic dichlorvos （OP） exposure in rat brain [J]. Neurotoxicology， 2007， 28（6）：1208.

[8]Blanco G. Na，K-ATPase subunit heterogeneity as a mechanism for tissue-specific ion regulation [J]. Semin Nephrol， 2005， 25（5）：292.

[9]Kopacha O， Kruglikov I， Pivneva T， et al. Mitochondria adjust Ca2+ signaling regime to a pattern of stimulation in salivary acinar cells [J]. BBA Mol Cell Res， 2011， 1813（10）： 1740.

[10]Agarwal A， Bolisetty S. Adaptive responses to tissue injury： role of heme oxygenase-1[J]. Trans Am Clin Climatol Assoc， 2013（124）：111.

[11]Jazwa A， Cuadrado A. Targeting heme oxygenase-1 for neuroprotection and neuroinflammation in neurodegenerative diseases [J]. Curr Drug Targets， 2010， 11（12）： 1517.

[责任编辑曹阳阳]