总结了前人各家之说创作了十八反的歌诀，其中人参作为“百草之王”应用于数万方剂中，与藜芦的相反作用也成为最有代表性配伍禁忌之一。
目前，关于“十八反”的作用机制的争论主要集中在配伍后会增加毒性或降低药效两个方面[1～3＼]。但是在临床应用、合用后化学成分变化、药效毒理以及药物吸收代谢等方面的研究表明，“十八反”都没有明显一致的规律[4＼]。因此有效地结合新的研究技术及方法对配伍的每一个环节，如体内吸收、分布、代谢、排泄和生理病理变化等情况进行考察，挖掘其中的内在联系，有助于揭示“十八反”的科学内涵[5，6＼]。
代谢组学作为系统生物学的分支，是研究代谢组在新陈代谢某一动态时刻的变化规律的一门学科[7＼]。它将人体作为一个完整的动态系统，因此被越来越多地应用于中医中药的相关研究中[8，9＼]。目前，最常用的分析方法是核磁共振（NMR）和各种质谱联用，如液质联用（LCMS，UPLCMS，UPLCMS/MS），JP气质联用（GCMS，GCQTOFMS/MS），电泳质谱联用（CEMS）和等离子体质谱（ICPMS）等[9，10＼]。
代谢组学按其研究的目的可分为靶向和非靶向代谢组学。其中靶向代谢组学是研究少数几种或几类结构、性质相似或生化功能相关的内源性代谢物。非靶向代谢组学则是针对生物样品中尽可能多的内源性代谢物进行研究[11＼]。
本研究拟通过采用非靶向代谢组学的研究方法，结合UPLCMS联用技术，在病理生理条件下考察“十八反”中人参与藜芦这一具有代表性的反药配伍组合干扰、改变、降低或消除药效的作用机制，为更好地诠释中医药配伍禁忌传统理论提供科学依据。
2实验部分
2.1仪器与试剂
WatersAcquityUPLC液相色谱系统、QTOFSYNAPTG2HDMS质谱仪（美国Waters公司）；MilliQ超纯水仪（美国Millipore公司）；BC5300Vet全自动血液细胞分析仪（中国深圳迈瑞公司生物医疗电子股份有限公司）；乙腈、甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）；红细胞、白细胞、血红蛋白生化测定试剂盒（中国长春汇力生物技术有限公司）。
人参（PanaxginsengC.A.Mey.）购自吉林抚松县万良人参市场，藜芦（VeratrumnigrumL.）购自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，分别取人参、藜芦及人参藜芦（以人参：藜芦10KG-3∶KG-51比例合用）药材适量，加10倍体积水浸泡1h，加热回流提取两次，每次1.5h，合并提取液，浓缩后冻干，保存备用。
Wistar大鼠（中国吉林大学白求恩医学院动物实验中心），实验动物许可证：SCXK（吉）20130001。
2.2动物实验
雄性Wistar大鼠随机分成5组，分别为空白组、模型组、人参组、藜芦组、参藜组。空白组及模型组给予相同体积蒸馏水，其余各组分别灌胃给予相应药物，每日1次，连续15d。
除空白组外，其余各组在给药同时开始造模[13＼]。造模第1天灌胃50°白酒10mL/kg，第2天以后每天灌胃食醋10mL/kg，同时喂饲体质量5%的硝黄饲料（正常饲料、大黄粉、芒硝，以60KG-3∶KG-51KG-3∶KG-51的比例（质量比）混合均匀，即成），每日下午大鼠背部固定质量约为体质量10%的铁丝，放入水深50cm、水温25℃～27℃的水槽中游泳，以力竭为度（大鼠鼻尖没入水面10s以上），共15d。期间空白组大鼠喂饲正常饲料并进行常规饲养。
第14d给药1h后，测定各组大鼠力竭游泳时间，并放入代谢笼中收集24h尿液，离心，
80℃保存备用。第15d给药1h后，麻醉大鼠，腹主动脉取血测定红细胞、白细胞、血红蛋白含量。
2.3色谱质谱条件及样品分析
选用WatersACQUITYUPLCBEHC18色谱柱（50mm×2.1mm，1.7μm）。
色谱条件：A乙腈，B超纯水（0.1%甲酸）；梯度洗脱：0～3min，5%～20%A；3～6min，20%～50%A；6～9min，50%～100%A。柱温：30℃；流速：0.4mL/min，进样量5μL。
质谱条件：离子源ESI；电离源温度120℃；锥孔气为氮气，流速50L/h；去溶剂气为氮气，温度350℃，流速800L/h。正离子模式下毛细管电压3.0kV，锥孔电压35V，提取锥孔电压5.0V；负离子模式下毛细管电压2.0kV，锥孔电压35V，提取锥孔电压5.0V。
在本实验中，使用质控样品（Qualitycontrol，QC）进行方法验证，用以保证整个分析系统的稳定性。QC样品是由每个样品各取100μL混合得到，为降低误差，样品检测为随机进行。在对样品进行分析前，为平衡系统先运行5次QC样品。在样品的检测过程中，每检测5个正常样品后运行1次QC样品，以衡量系统的稳定性。
2.4数据处理
采用MassLynxV4.1和MarkerLynxApplicationManager对UPLC/QTOFMS检测得到的数据进行峰检测、峰对齐以及归一化。使用EZinfo2.0软件中的PCA和OPLSDA进行多元变量分析。使用SPSS13.0软件进行组间t检验。使用生物学数据库HMDB（http：///）进行潜在生物标志物的鉴定和代谢通路的分析。JP
3结果与讨论
3.1人参、藜芦及人参藜芦配伍合用对脾气虚模型大鼠力竭游泳时间的影响
游泳耐力下降是脾气虚证实验动物模型最显著的表现之一[14＼]。本实验结果（表1）显示，与空白组比较，模型组大鼠力竭游泳时间明显降低；与模型组比较，人参组大鼠力竭游泳時间显著延长，藜芦组无明显变化，表明人参能够改善脾气虚模型大鼠游泳耐力下降的状况，但与藜芦配伍合用后在一定程度上降低了这种作用。LM
3.2人参、藜芦及人参藜芦配伍合用对ZH（脾气虚模型大鼠血液中白细胞、红细胞、血红蛋白含量的影响
传统中医认为气在机体内具有防御作用，气不足时会导致脏腑组织功能低下或衰退，其与现代免疫学有着相似之处，现代医学认为红细胞和血红蛋白下降会影响人体气体交换，进而影响中医气的生成[14＼]。本实验结果（表2）表明，与空白组比较，模型组大鼠白细胞、红细胞及血红蛋白明显降低（p<0.01）；与模ZH）型组比较，人参组大鼠白细胞、红细胞及血红蛋白均显著升高（p<0.05，p<0.01），藜芦组及参藜组大鼠无明显变化，表明人参可明显的调节脾气虚模型大鼠血液中白细胞、红细胞及血红蛋白含量，但与藜芦配伍合用后其调节作用明显减弱。
3.3人参、藜芦及人参藜芦配伍合用对脾气虚模型大鼠影响的尿液代谢组学研究
3.3.1尿液代谢轮廓分析采用UPLC/QTOFMS分别在正、负离子模式下对样本进行分离和数据采集。图1为各组典型的总离子流基峰强度色谱图（BPI）。
应用主成分分析法（PCA）对QC样本进行数据分析，从图2可见，正离子和负离子模式下QC样本与正常尿液样本能够明显分离，且QC样本之间聚集紧密，进一步验证了分析系统的稳定性。
由空白组、模型组、人参组、藜芦组和参藜组的PCA得分图（图3）可见，在正谱或负谱中，空白组、模型组和人参组大鼠尿液代谢物可明显区分，说明与正常大鼠比较，脾气虚模型大鼠体内代谢产生了扰动，而人参能够在一定程度上调节这一扰动趋于正常。而藜芦组和参藜组代谢物与模型组区分不明显，说明其对脾气虚模型大鼠体内的代谢扰动没有调节作用或调节较小。在PCA及OPLSDA模型中，R2X和R2Y表示模型对于数据中自变量X和因变量Y的模拟程度，Q2表示模型对数据的预测程度，这两个值越接近1表示模型越好。其中正离子模式下模型的R2X=0.902，Q2=0.816，负离子模式下模型的R2X=0.897，Q2=0.803。
3.3.2潜在标志物鉴定对人参组和模型组尿样进行正交偏最小二乘法判别分析（OPLSDA）。正离子模式下模型的R2Y=0.913，Q2=0.882，负离子模式下模型的R2Y=0.924，Q2=0.905，说明模式质量良好。如OPLSDA得分图（图4A1，4B1）所示，人参组和模型模型组可以明显区分。其中远离原点的化合物为潜在的标志物（如图4A2，4B2），同时以p>1且有统计学意义的变量（p<0.05）作为标记物的判断标准，并通过数据库进行质谱信息匹配及标准品串联质谱验证的方法找出15种人参干预脾气虚大鼠的潜在生物标志物。同时按照上述方法对参藜组尿样进行了进行正交偏最小二乘法判别分析（OPLSDA），找出了7种人参藜芦配伍合用后对人参上述调节作用产生影响的潜在生物标志物（表3），并对其相对含量进行了统计分析（图5）。结果表明，人参对于二氢硫辛酸、3氧肉豆蔻酸、15脱氧Δ12，14前列腺素J2、5羟基N甲酰犬尿氨酸、L谷氨酸、L乳酸、吲哚乙酸等潜在生物标志物具有显著的调节作用，而与藜芦配伍合用后对上述潜在生物标志物的调节作用明显减弱，提示人参藜芦配伍合用后可能在一定程度上降低了人参对脾气虚模型大鼠的干预作用。
3.4生物标志物代谢通路分析
5羟基N甲酰犬尿氨酸（5HydroxyNformylkynurenine）、吲哚乙酸（Indoleaceticacid）是色氨酸代谢LM
通路下游代谢产物[15＼]。其中色氨酸是一种必需氨基酸，在机体中起着至关重要的作用，在能量代谢中是蛋白质合成或分解的中间体[16，17＼]。
通过犬尿氨酸途径的色氨酸代谢被认为是免疫系统中不断调节病原体和抗原之间平衡的机制之一[18＼]。人参给药后尿液中5羟基N甲酰犬尿氨酸及吲哚乙酸含量增加，对脾气虚模型大鼠体内色氨酸代谢具有促进作用，间接表明人参对能量代谢具有一定促进作用，此外，Li等[19＼]在对人参总皂苷抗应激作用的代谢组学研究中也发现人参对5hydroxyNformylkynurenine含量具有调节作用，与本研究结果相似。而当人参与藜芦配伍合用后，尿液中这两种物质含量有所降低，从而影响了人参的上述促进作用。
3氧肉豆蔻酸（3Oxotetradecanoicacid）、L乳酸（LLacticacid）分别是脂肪酸生物合成及丙酮酸代谢的合成代谢产物[20＼]。脂肪酸在人体中发挥着重要的生理作用，它通过β氧化直接生成乙酰辅酶A，而糖在体内通过糖代谢可生成丙酮酸，也可进一步生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进入到三羧酸循环，产生能量，三羧酸循环是能量代谢的重要途径之一[21～23＼]。人参给药后尿液中3氧肉豆蔻酸及L乳酸含量增加，加速了脾气虚模型大鼠体内三羧酸循环，促进了能量代谢，而与藜芦配伍合用后明显抑制了这一促进作用。
L谷氨酸（LGlutamicacid）是谷胱甘肽的代谢产物，是机体内十分重要的抗氧化剂和自由基清除剂[24＼]。人参能够增加脾气虚模型大鼠尿液中L谷氨酸的含量，加速谷胱甘肽代谢，进而起到增强抗氧化作用，而与藜芦配伍合用后尿液中L谷氨酸的含量，降低了人参的上述作用。
15DeoxyΔ12，14PGJ2是花生四烯酸的代谢产物，花生四烯酸在体内能够起到第二信使的作用，能使腺苷酸环化酶活化致使细胞内cAMP浓度增高。此外，还参与了体内造血和免疫调节作用[25，26＼]。脾气虚大鼠经人参治疗后，15DeoxyΔ12，14PGJ2的含量降低，在一定程度上抑制了花生四烯酸的代谢，表明人参促进了脾气虚模型大鼠的免疫调节作用，而与藜芦配伍合用后降低了人参对免疫系统的调节作用。
4结论
本研究采用UPLCQTOFMS联用技术，对人参、藜芦及人参藜芦配伍合用后对脾气虚模型大鼠尿液进行了非靶向代谢组学研究。共鉴定出15种人参干预脾气虚大鼠的潜在生物标志物，同时在其中找出了7种人参藜芦配伍合用后对人参上述调节作用产生影响的潜在生物标志物，主要参与体内脂肪酸生物合成、花生四烯酸代谢、色氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、丙酮酸代谢等代谢通路。表明人参藜芦配伍合用后通过影响上述代谢途径而妨害了人参对脾气虚模型大鼠增强能量代谢、调节免疫、抗氧化等治疗作用的发挥，初步阐明了人参藜芦配伍禁忌的作用机理。
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AbstractAurinaryuntargetedmetabonomicsmethodbasedonUPLC/QTOFMSwasestablishedtoinvestigatethemechanismofcompatibilityofPanaxginsengandVeratrumnigruminSpleenqideficiencyrat.Spleenqideficiencyratmodelwasestablished，thentheexhaustiveswimmingtimeandthecontentofwhitebloodcells，redbloodcellandhemoglobininthebloodwasdetectedafteradministrationfor15days.TheresultsshowedthatPanaxginsengcouldincreasetheexhaustionswimmingtime（p<0.01）andthecontentofwhitebloodcells，redbloodcellandhemoglobinintheblood（p<0.05，p<0.01）ofspleenqideficiencyrats，andVeratrumnigrumorcompatibleapplicationhadnosignificanteffectindexmentionedabove（p>0.05）.TheurinarymetabolicprofilingwasanalyzedbyusingUPLC/QTOFMSandtheobtaineddatawereanalyzedbyPCA.ThescoreofPCAshowedthattherewassignificantdifferenceamongthemetabolicprofileofdifferentgroups.AccordingtotheresultsofOPLSDAandthedatabases，fifteenpotentialbiomarkerswereidentifiedasthetherapeuticeffectofPanaxginseng，andsevenofthemandtheirpathwayswereconsideredasreducingthetherapeuticeffectofPanaxginsengbycoadministrationwithVeratrumnigrum.TheresultsindicatedthattheeffectofPanaxginsengonpromotingenergymetabolism，regulatingimmuneandantioxidationinthespleenqideficiencyratsweredecreasedafterthecompatibilityofPanaxginsengandVeratrumnigrum.
KeywordsPanaxginseng；Veratrumnigrum；Incompatibility；Spleenqideficiency；Untargetedmetabonomics
HQWT6JY（Received24March2016；accepted12August2016）
ThisworkwassupportedbytheNationalBasicResearchProgramofChina（973Program）（Nos.2011CB505300，2011CB505305）
推荐访问： 靶向 妨害 人参 代谢 脾气