血水草根蛋白质组学研究

材料

血水草采自湖南省益阳市桃江县飞山崖，采摘时间为秋季，经湖南中医药大学周天达教授鉴定为罂粟科（Papaveraceae）白屈菜族（Chelidonium）血水草属（Eomecon）植物血水草（Eomecon chionantha Hance）.取血水草成熟根，清水洗净后，晾干，-20 ℃储存.

2 主要仪器与试剂

2.1 仪器

Protein Ⅱ垂直电泳槽为Bio-Rad 公司产品；Multistemp Ⅲ图像扫描仪、恒温制冷循环水浴箱、图像分析软件Imagemaster 2-D Platinum Software 5.0和IPG等电聚焦仪均为 Amersham Biosciences 产品； BP211D电子天平为德国Sartorius 公司产品； 质谱仪Ultraflex MALDI-TOF-TOF 为德国Bruker Daltonics 产品；GelDoc 2000 凝胶成像仪为Bio-Rad公司产品；Savant冷冻干燥机为美国Thermo Electron公司产品.

2.2 试剂

线性固相pH梯度预制胶条 （IPG strip pH 3～10，17 cm），两性电解质，2D Quant Kit 定量试剂盒，IPG 缓冲液，蛋白质裂解液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，0.2%Tris， 使用前加入75 mmol/L DTT和2 mmol/L PMSF），DeStreak Rehydration Solution均为Amersham Biosciences 产品；四甲基乙烯基二胺（TEMD），过硫酸胺（APS），二硫苏糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），硫酸铵，甲叉双丙烯酰胺，三氯乙酸（TCA），丙烯酰胺，三羟甲基氨基甲烷（Tris），胰蛋白酶和考马斯亮蓝G250均为Sigma 产品； CCA为Bruker Daltonics产品.

3 方法

3.1 血水草根总蛋白的提取及定量

将血水草根用清水彻底洗干净，剪碎，TCA-丙酮悬浮后，超声，再加入裂解液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，75 mmol/L DTT，2 mmol/L PMSF，4%CHAPS，0.2%Tris），充分研磨后，在冰上超声裂解，静置10 min离心，收集上清.在上清液中加入提取液（含0.07%β-巯基乙醇和10%TCA的丙酮），-20 ℃过夜，离心，弃上清.沉淀中加入预冷丙酮，沉淀8 h，离心弃上清，裂解液重新溶解沉淀.用2-D Quant kit试剂盒测定总蛋白浓度.样品置-80 ℃ 保存备用.

3.2 双向凝胶电泳及凝胶图像分析

样品蛋白质通过双向凝胶电泳进行分离.第一向上样量为600 μg，等电聚焦电泳采用17 cm， pH 3～10的IPG胶条；第二向采用12% SDS-PAGE的分离胶分离.将电泳后的凝胶先置于固定液（40%甲醇，10%乙酸）中固定30 min，再置于考马斯亮蓝染液（25%甲醇，10%磷酸，10%硫酸铵，0.1%考马斯亮蓝G250）中染色过夜.用双蒸水清洗凝胶，直至背景清晰，凝胶经图像扫描仪扫描，用图像分析软件对蛋白质点进行检测分析.

3.3 质谱鉴定

切取蛋白质点放置在EP管中，加入50 μL脱色液（50%乙腈，25 mmoL碳酸氢铵），脱色后加入乙腈干胶，再置于真空干燥仪中干燥.干燥后的胶块中加入胰酶溶液，冰水浴1 h，37 ℃消化18～24 h，离心，弃上清.加入萃取液（50%乙腈，5%三氟乙酸）覆盖胶块，37 ℃保温1 h，离心，收集萃取液，冻干至样品体积约为5 μL，再将样品与CCA基质液以体积比1∶1混匀，点样于AnchorChip板上，进行MALDI-TOF-TOF质谱分析.质谱参数如下：激光源为337 nm的氮气激光，发射模式离子源1电压25 kV，离子源2电压21.8 kV，均在正离子模式下检测.用BioTools 2.2软件整合PMF和LIFT质谱结果，对IPI数据库搜索.查询条件：切割酶为胰蛋白酶，允许最大末酶切位点数为1，PMF误差为5×10-5，MS/MS 误差0.6，考虑甲硫氨酸残基的氧化.

4 结果

4.1 血水草根的2-DE图谱

在相同条件下对血水草根蛋白样品进行双向电泳，得到了一致性较好的电泳图谱（见图1）.从图1中可以看出，2-DE图谱背景较浅，蛋白点的分布均匀，大小蛋白质组分斑点均清晰可见，达到预期分离效果.图谱通过Imagemaster 2-D软件分析，结果显示平均检测到（464±10）个蛋白质点（n=3） 匹配率为84.5%，经蛋白质斑点回顾性分析，选取237个蛋白质点，进行质谱分析.

4.2 蛋白质点的质谱分析

选取蛋白质点237个，通过MALDI-TOF-TOF成功鉴定28个蛋白质（图2，表1）.其中具有明确功能的蛋白质有17种，按照蛋白质动能分类分别属于DNA复制酶、翻译调控蛋白、代谢酶、细胞结构蛋白；另外11种为未知功能蛋白.

5 讨论

血水草，各地俗称较多，例如水黄莲、捆仙绳、黄水草、广扁线、马蹄草等 [12]，生长在山野、路旁、溪边、林边等较潮湿的泥土内，取材容易.从血水草的根及根茎中提取的生物碱（Eomecon Chionantha Alkaloids，简称ECA），包括血根碱、白屈菜红碱、白屈菜红默碱、原阿片碱和α-别隐品碱等，分属苯骈菲啶或阿片型生物碱[13].这些生物碱具有抗菌、增强免疫、抗癌、松弛平滑肌、镇痛与镇静的作用等[14-16].近几年发现生物碱具有杀灭日本血吸虫尾蚴及中间宿主钉螺的作用[17-19].血水草的应用价值得到越来越多的关注.作者对血水草的根进行蛋白质组学研究，经双向电泳分离和考马斯亮蓝染色后，选取了表达量丰富的237个蛋白质点进行质谱鉴定，成功鉴定了28个蛋白质点，大致可分为DNA复制酶、翻译调控蛋白、代谢酶和细胞结构蛋白.

（1）参与DNA 复制、翻译、转录过程蛋白：在生物体内，核酸酶在维持基因组完整性和DNA的损伤修复过程中至关重要，核酸酶结构、表达量或功能的改变，会影响到基因组完整性以及DNA 的损伤修复[20].DNA 连接酶是生物体内极为重要的酶，可以分为两种：一是利用ATP的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖ATP 的DNA 连接酶；二是利用NAD+的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖NAD+的DNA 连接酶[21].DNA聚合酶是细胞复制DNA的重要作用酶，在具备模板、引物和dNTP等的情况下它能将4种脱氧核苷三磷酸聚合成一条DNA 链.转座酶能特异地识别转座子两端的DNA 序列.在转座酶作用下，转座因子在同一细胞内从一个DNA 位置转移到另一个位置.成熟酶K与内含子RNA结合，使之折叠成有催化活性的结构，从而促进前体RNA剪接， 直接在翻译水平影响基因的表达[22].有研究结果发现，烟草打顶后成熟酶K表达上调， 表明烟草打顶处理能通过增加成熟酶K的表达，增强对RNA内含子的剪切，从而影响6-磷酸山梨醇脱氢酶、氨甲酰磷酸转移酶、精胺/亚精胺合成酶等调控碳氮代谢的酶基因的表达水平， 进而影响烟碱合成的相关生理过程[23].

（2）代谢酶：此次鉴定成功的代谢酶有ATP合酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶、亚硫酸盐还原酶、多属性脱氢酶、一氧化氮还原酶、琥珀酰辅酶A合成酶.生物有机体中，ATP的合成是最主要的化学反应之一.ATP合酶广泛分布于叶绿体类囊体、线粒体内膜、异养菌和光合菌的质膜上，参与氧化磷酸化和光合磷酸化，在跨膜质子动力势的推动下合成ATP.ATP合酶的β亚基与核苷酸结合后，具有催化 ATP 合成或水解的活性 [24].腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）是葡萄糖合成的供体，葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶主要催化葡萄糖-1-磷酸与ATP合成 ADPG，这在植物淀粉合成中是主要的调节步骤，是植物光合和非光合组织中淀粉合成的起始步骤[25].亚硫酸盐还原酶是催化亚硫酸盐还原为硫化物的酶， 在植物生命活动中具有关键作用 [26].脱氢酶是一种氧化还原酶， 在生物细胞内催化有机物氧化脱氢， 并将其传递给最终受氢体.脱氢酶参与的生物反应包括光合作用、氨基酸合成和降解、脂肪的氧化和合成、丙酮酸的氧化、戊糖磷酸途径等， 为生物体提供必不可少的能量[27].一氧化氮在一氧化氮还原酶的作用下，被还原成N2O.琥珀酰辅酶A合成酶（SCS）由α和β两种亚基构成，是柠檬酸循环的重要组成成分，催化该循环中底物磷酸化的步骤[28].

（3）细胞结构蛋白：脂蛋白是蛋白质与脂肪或类脂结合而成的一类复杂蛋白.脂质通常以非共价键与蛋白质结合，广泛存在于生物膜以及动物的血浆和乳汁中，在生物膜的功能中起十分重要的作用.除成熟红细胞外，所有细胞中都有核糖体存在.核糖体是细胞的重要结构之一，是合成蛋白质的细胞器，其唯一的功能是将氨基酸装配成肽链.肌动蛋白是一种高度保守的蛋白质，是细胞骨架的主要组成成分，它不仅参与维持细胞形态和结构，而且在细胞分裂与分化、信号转导、细胞运动等诸多方面具有重要功能[29].

（4）未知功能蛋白：此次实验还鉴定了几种未知功能蛋白，如蛋白酶3型、逆转录转座子蛋白、未知蛋白等.这些蛋白是根据其核苷酸序列确定的，可能是血水草特有的蛋白质或者是其他生物的蛋白质，目前尚未进行研究.

本研究初步建立了血水草根2-DE参考图谱，为建立血水草蛋白质组数据库提供了必要的资料.血水草的蛋白质构成研究，为血水草开发应用提供理论基础，特别是为血水草作为植物杀螺、灭蚴剂得以在流行区广泛种植及开发成转基因植物提供理论基础.

参考文献：

[1]PARK E， DRAKAKAKI G. Proteomics of endosomal compartments from plants case study： isolation of trans-Golgi network vesicles[J]. Methods Mol Biol， 2014，1209：179-187.

[2]KOMATSU S， KONISHI H， HASHIMOTO M. The proteomics of plant cell membranes[J]. J Exp Bot， 2007，58（1）：103-112.

[3]NGARA R， NDIMBA B K. Model plant systems in salinity and drought stress proteomics studies： a perspective on Arabidopsis and Sorghum[J]. Plant Biol， 2014，16（6）. doi： 10.1111/plb.12247.

[4]KRISHNAMURTHY P， TAN X F， LIM T K， et al. Proteomic analysis of plasma membrane and tonoplast from the leaves of a mangrove plant Avicennia officinalis[J]. Proteomics， 2014，14（21/22）. doi： 10.1002/pmic.201300527.

[5]KOMATSU S， TANAKA N. Rice proteome analysis： a step toward functional analysis of the rice genome[J]. Proteomics， 2005，5（4）：938-949.

[6]KOMATSU S. Rice proteome database： a step toward functional analysis of the rice genome[J]. Plant Mol Biol， 2005，59（1）：179-190.

[7]PORUBLEVA L， VANDER V K， KOTHARI S， et al. The proteome of maize leaves： use of gene sequences and expressed sequence tag data for identification of proteins with peptide mass fingerprints[J]. Electrophoresis， 2001，22（9）：1724-1738.

[8]GALLARDO K， JOB C， GROOT S P， et al. Proteomic analysis of arabidopsis seed germination and priming[J]. Plant Physiol， 2001，126（2）：835-848.

[9]CHANG WW， HUANG L， SHEN M， et al. Patterns of protein synthesis and tolerance of anoxia in root tips of maize seedlings acclinated to a low-oxygen environment， and identification of proteins by mass spectrometry[J]. Plant Physiol， 2000，122（2）：95-138.

[10]陈 香，胡雪华，陆耀东，等.中国特有植物血水草开花物候与生殖特性[J].生态学杂志， 2011，30（9）：1915-1920.

[11]刘 铭，彭 玲.血水草生物碱的药理作用[J].湖南中医杂志， 2009，25（3）：128-130.

[12]吴征镒. 中国植物志：第三十二卷[M]. 北京： 科学技术出版社，1999.

[13]左雄军，李 静. 血水草生物碱的HPLC分离[J]. 分析测试学报， 1999，18（6）：50-52.

[14]KAMINSKYY V， LIN K W， FILYAK Y， et al. Differential effect of sanguinarine， chelerythrine and chelidonine on DNA damage and cell viability in primary mouse spleen cells and mouse leukemic cells[J]. Cell Biol Int， 2008，32（2）：271-277.

[15]ZDARILOVA A， MALIKOVA J， DVORAK Z， et al. Quaternary isoquinoline alkaloids sanguinarine and chelerythrine in vitro and in vivo effects[J]. Chem Listy， 2006，100（1）：30-41.

[16]XIAO X， LIU J， HU J， et al. Protective effect of protopine on the focal cerebral ischaemic injury in rats[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol， 2007，101（2）：85-89.

[17]彭 玲，黄琼瑶，刘建军，等.血水草生物碱致钉螺肝脏蛋白质差异表达分析[J].中草药， 2010，41（3）：431-435.

[18]彭 玲，袁仕善，杨盛清，等. 血水草生物碱对钉螺肝脏损伤机理的研究[J]. 中草药， 2011，42（1）：127-129.

[19]黄琼瑶，彭 飞，刘年猛，等.血水草生物碱杀灭钉螺的研究[J].中国血吸虫病防治杂志， 2004，16（1）：55-57.

[20]陈 雳，张国元，赵明才. 核酸酶与自身免疫性疾病[J].免疫学杂志， 2011，27（3）：267-270.

[21]张 波，孟紫强. DNA连接酶同工酶的研究进展[J].生物化学与生物物理进展， 2001，28（5）：639-641.

[22]VO GEL J， HUBSEHMAN T， BO RNER T， et al. Splicing and intron-internal RNA editing of trnk-matk transcripts in barley plastids：support for MatK as an essential splice factor[J]. J Mol Biol， 1997，270（2）：179-187.

[23]刘卫群，李 浩，郭红祥，等. 烤烟打顶前后差异表达蛋白分析[J]. 烟草农业科学， 2008，4（1）：30- 35.

[24]林茂兹，张志兴，林争春，等.太子参连作障碍蛋白差异表达分析[J].草业学报， 2010，19（6）：199-209.

[25]刘红星，王蕴波，年 海，等.超甜玉米ADPG-PPase 活性与糖份含量的相关分析及评价[J]. 佛山科学技术学院学报（自然科学版）， 2009，27（3）：1-4.

[26]刘晓华，万海清.亚硫酸盐还原酶的分离纯化和酶学性质的研究[J]. 酿酒科技， 2006，6（1）：28-31.

[27]解 军，祁 峰，裴海燕，等.脱氢酶活性检测方法及其在环境监测中的应用[J]. 中国环境监， 2006，22（5）：13-18.

[28]王钦岩，朱圣庚，徐长法.生物化学[M].3版.北京：高等教育出版社， 2002.

[29]RODRIGUEZ-ORTEGA M J， GROSVIK B E， RODRIGUEZ-ARIZA A， et al. Changes in protein expression profiles in bivalve molluscs （Chamaelea gallina） exposed to four model environmental pollutants[J]. Proteomics， 2003，3（8）：1535-1543.

（编辑 WJ）