材料对293T细胞无明显的毒性作用，且可显著提高pEGFP的细胞转染效率。[结论]柠檬酸钠修饰的磷酸钙纳米颗粒安全性好，具有较强的基因转染能力，是一种潜在的DNA疫苗载体或佐剂。
关键词 磷酸钙；纳米材料；基因转染；DNA疫苗
中图分类号 R318.08 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）32-203-03
Abstract[Objective]To evaluate the gene transfection capability of calcium phosphate nanoparticles and confirm its potential adjuvant activity for DNA vaccines.[Method]Sodium citrate was selected as dispersing agent and calcium phosphate nanoparticles with narrow size distribution were synthesized using coprecipitation method. The safety issue of the nanoparticles was investigated using cytotoxicity assay. Meanwhile，its gene transfection capability was evaluated through fluorescence microscopy and flow cytometry.[Result]Calcium phosphate nanoparticles with narrow size distribution were successfully prepared and its mean hydrodynamic diameter and zeta potential were 692.6 nm and -11.1 mV，respectively. Moreover，the nanoparticles showed no apparent toxicity to 293T cells and could significantly promote the transfection efficiency of pEGFP.[Conclusion]Sodium citratecoated calcium phosphate nanoparticles with good safety and high gene transfection capability could be a potential carrier and/or adjuvant for DNA vaccines.
Key words Calcium phosphate； Nanomaterials； Gene transfection； DNA vaccines
目前临床上疫苗多采用减毒或灭活的病毒/细菌作为载体，然而其潜在的安全性问题限制了其在临床上的广泛应用。近年来，DNA疫苗由于生产成本低、安全性好，可同时携带多种抗原且能同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫反应，逐渐成为疫苗研究领域的热点[1]。然而，由于裸DNA很难进入机体且极易被核酸酶降解，从而严重影响了其免疫原性[2]。因此，研究开发出安全、有效的疫苗载体或佐剂成为目前亟待解决的问题。
相对于病毒载体，非病毒载体具有更好的安全性。近年来，由于纳米技术的飞速发展，作为非病毒载体，纳米材料由于其易于合成和加工修饰、可促进功能分子进入细胞等特点而越来越受到人们的关注。理想的疫苗佐剂应该具有增强抗原的免疫原性；可同时刺激机体产生细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫反应；生物可降解、经济且易于制备等特点。铝佐剂和MF59是目前公认的可用于人体的2种疫苗佐剂，然而这2种佐剂均难以有效刺激机体产生细胞免疫反应[3]。同时，铝佐剂可导致注射部位炎症反应的发生且持续时间较长[4]。相对于铝佐剂，磷酸钙具有更多优势，如生物可降解、对注射部位无刺激等。欧洲一些国家已批准磷酸钙作为佐剂应用于人体[5]。磷酸钙颗粒的合成方法主要包括共沉淀法[6]和反向微乳液法[7-10]等。然而，共沉淀法制备的磷酸钙颗粒粒径较大且分布较宽，造成了其功能方面如基因转染效率较低，重复性差[11]。反向微乳液法制备的磷酸钙颗粒尺寸可控性好，但产量较低，从而也在一定程度上限制了其在临床上的广泛使用。He等[12-13]利用柠檬酸钠与钙离子的螯合作用，在共沉淀反应过程中引入柠檬酸钠，合成了一种磷酸钙纳米颗粒，发现与铝佐剂相比其可显著促进HSV2蛋白质抗原的免疫原性，刺激机体产生更高效价的抗体且对注射部位无刺激作用。同时，该磷酸钙纳米颗粒可刺激机体产生黏膜免疫反应，因此其可作为潜在的黏膜免疫佐剂保护机体免受病毒的感染。然而，该磷酸钙纳米颗粒是否可作为疫苗载体或佐剂提高DNA抗原的免疫原性则尚不清楚。笔者旨在通过评价该磷酸钙纳米颗粒的基因转染能力，从而初步确定其是否可作为一种潜在的DNA疫苗载体或佐剂。
1 材料与方法
1.1 材料
293T细胞购自美国ATCC公司；DMEM细胞培养基、琼脂糖、DNA分子量标准购于美国Thermo Fisher Scientific公司；增强型绿色荧光蛋白质粒DNA（pEGFP）购于美国Clontech公司；3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴盐（MTT）购于美国Sigma公司；胎牛血清购自上海普飞生物技术有限公司，氯化钙、磷酸二氢钠、柠檬酸三钠购于国药集团化学试剂有限公司。
琼脂糖凝胶电泳仪和凝胶成像仪购于北京六一生物科技有限公司；磁力搅拌器购于德国IKA公司；倒置荧光显微镜购于日本奥林巴斯株式会社；酶联免疫检测仪购于美国BioRad公司；流式细胞仪（BD Calibur）购于美国BD公司。
1.2 方法
1.2.1 磷酸钙纳米颗粒-pEGFP复合物的制备与表征。
将7.5 ml氯化钙水溶液（12.5 mmol/L）加入玻璃瓶中，置于磁力搅拌器上。并在搅拌过程中，缓慢滴加7.5 ml磷酸二氢钠水溶液（12.5 mmol/L）。向上述混合物中缓慢滴加1.5 ml柠檬酸钠水溶液（15.6 mmol/L），继续搅拌约12 h。14 800 r/min，离心15 min。同时，将沉淀分散于1 ml去离子水中，利用马尔文激光粒度仪对其粒径和电势进行表征[12-13]。
1.2.2 磷酸钙纳米颗粒的细胞毒性评价。设空白对照组（即培养基处理组）和磷酸钙纳米颗粒处理组。以0.25%胰酶消化293T细胞，终止消化后，以1 000 r/min，离心5 min。用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基制成单细胞悬液，并以5×104/ml浓度接种于96孔板中，每孔100 μl。置于培养箱（37 ℃、5% CO2）中，继续培养24 h。之后，弃去培养基，分别加入新鲜完全培养基和不同浓度梯度的磷酸钙纳米颗粒，磷酸钙纳米颗粒的工作浓度为6.25、12.50、25.00、50.00和100.00 μg/ml，置于培养箱中继续孵育48 h。弃去培养基，并用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤2～3次。每孔加入120 μl含适当浓度MTT的培养基，继续培养4 h。最后，每孔加入150 μl二甲基亚砜，置于摇床上，避光条件下，低速振荡10 min。利用酶联免疫检测仪在490 nm处检测吸光度，确定磷酸钙纳米颗粒的细胞毒性。
1.2.3 磷酸钙纳米颗粒基因转染效率的评价。
参照“1.2.1”方法制备磷酸钙纳米颗粒-pEGFP复合物。具体方法：将100 μg pEGFP质粒DNA溶于7.5 ml氯化钙水溶液（12.5 mmol/L）加入玻璃瓶中，置于磁力搅拌器上。之后与“1.2.1”中所述方法完全相同，分别加入磷酸二氢钠和柠檬酸钠，反应12 h后，14 800 r/min，离心15 min。取上清，利用核酸分析仪检测上清中游离质粒DNA的含量，从而确定磷酸钙纳米颗粒包裹DNA的效率。同时，将沉淀分散于1 ml无菌水中，最终获得磷酸钙纳米颗粒-pEGFP复合物（CAPNPpEGFP）。
参照“1.2.2”方法，将293T细胞悬液以5×104/ml浓度接种于24孔板中，置于培养箱（37 ℃、5% CO2）中，培养至对数生长期。弃去培养基，分别加入含游离pEGFP和磷酸钙纳米颗粒-pEGFP复合物的完全培养基，pEGFP的工作浓度均为3 μg/ml，继续孵育48 h。利用倒置荧光显微镜和流式细胞仪分别评价磷酸钙纳米颗粒的基因转染能力。
2 结果与分析
2.1 磷酸钙纳米颗粒-pEGFP复合物的制备与表征 激光粒度仪的表征结果显示，磷酸钙纳米颗粒的平均水合粒径为692.6 nm，多分散系数（polydispersity index，PDI）为0.149，粒径分布狭窄，表面电势为-11.1 mV（图1）。钙离子可通过与DNA螺旋结构区的磷酸根形成复合物[14]，因此磷酸钙纳米颗粒可在沉淀反应过程中包裹质粒DNA即pEGFP。根据公式：
包裹效率（%）=（DNA总量-上清中游离DNA）/DNA总量×100
利用核酸分析仪，可以确定磷酸钙纳米颗粒对pEGFP的平均包裹效率为15.5%。总DNA与上清中游离DNA的电泳结果则进一步证明（图2），部分pEGFP可被磷酸钙纳米颗粒成功包裹起来。
2.2 磷酸钙纳米颗粒的细胞毒性评价
对磷酸钙纳米颗粒的细胞毒性作用进行评价。结果显示，当材料处理细胞48 h，即使在高浓度（100 μg/ml），磷酸钙纳米颗粒依然未显示出对293T细胞明显的毒性作用，细胞活力仍在80%左右（图3）。
2.3 磷酸钙纳米颗粒的基因转染能力评价
由图4和图5可知，磷酸钙纳米颗粒可显著提高pEGFP质粒DNA对293T细胞的转染能力。这主要是由于游离DNA即pEGFP质粒DNA很难进入细胞且易被核酸酶降解，其对细胞的转染能力很弱。而当磷酸钙纳米颗粒将其包裹后，可有效促进其进入细胞，同时保护其免受酶的降解。这意味着作为DNA疫苗载体，磷酸钙纳米颗粒可通过包裹DNA抗原，保护其免受降解，且促进其被组织细胞尤其是免疫细胞如树突状细胞摄取，进而激活免疫细胞，提高抗原的免疫原性。
3 讨论
该研究采用He等[12-13]合成磷酸钙纳米颗粒的方法，成功制备了粒径分布狭窄的磷酸钙纳米颗粒，其对细胞未显示出明显的毒性作用，而且可有效促进pEGFP质粒DNA对293T细胞的转染效率。这表明该磷酸钙纳米颗粒可能作为DNA疫苗的载体或佐剂，进一步提高抗原的免疫原性。下一步将对磷酸钙纳米颗粒与免疫细胞尤其是抗原呈递细胞的相互作用，及其在动物试验水平是否具有疫苗载体或佐剂的功能进行系统地研究。
参考文献
[1]GURUNATHAN S，KLINMAN D M，SEDER R A.DNA vaccines：Immunology，application，and optimization[J].Annu Rev Immunol，2000，18：927-974.
[2]WILSONL K D，DE JONG S D，KAZEM M，et al.The combination of stabilized plasmid lipid particles and lipid nanoparticle encapsulated CpG containing oligodeoxynucleotides as a systemic genetic vaccine[J].J Gene Med，2009，11：14-25.
[3]PETROVSKY N，AGUILAR J C.Vaccine adjuvants：Current state and future trends[J].Immunol Cell Biol，2004，82：488-496.
[4]VASSILEV T L.Aluminum phosphate but not calcium-phosphate stimulates specific Ige response in guinea-pigs to tetanus toxoid[J].Allergy，1978，33：155-159.
[5]SINGH M，CARLSON J R，BRIONES M，et al.A comparison of biodegradable microparticles and MF59 as systemic adjuvants for recombinant gD from HSV-2[J].Vaccine，1998，16：1822-1827.
[6]PEDRAZA C E，BASSETT D C，MCKEE M D，et al.The importance of particle size and DNA condensation salt for calcium phosphate nanoparticle transfection[J].Biomaterials，2008，29：3384-3392.
[7]KONG X D，SUN X D，LU J B，et al.Mineralization of calcium phosphate in reverse microemulsion[J].Curr Appl Phys，2005，5：519-521.
[8]KESTER M，HEAKAL Y，FOX T，et al.Calcium phosphate nanocomposite particles for In vitro imaging and encapsulated chemotherapeutic drug delivery to cancer cells[J].Nano Lett，2008，8：4116-4121.
[9]BISHT S，BHAKTA G，MITRA S，et al.pDNA loaded calcium phosphate nanoparticles：Highly efficient non-viral vector for gene delivery[J].Int J Pharm，2005，288：157-168.
[10]MORGAN T T，MUDDANA H S，ALTINOG’LU E I，et al.Encapsulation of organic molecules in calcium phosphate nanocomposite particles for intracellular imaging and drug delivery[J].Nano Lett，2008，8：4108-4115.
[11]LUO D，SALTZMAN W M.Synthetic DNA delivery systems[J].Nat Biotechnol，2000，18：33-37.
[12]HE Q，MITCHELL A R，JOHNSON S L，et al.Calcium phosphate nanoparticle adjuvant[J].Clin Diagn Lab Immun，2000，7：899-903.
[13]HE Q，MITCHELL A，MORCOL T，et al.Calcium phosphate nanoparticles induce mucosal immunity and protection against herpes simplex virus type 2[J].Clin Diagn Lab Immun，2002，9：1021-1024.
[14]TRUONGLE V L，WALSH S M，SCHWEIBERT E，et al.Gene transfer by DNAgelatin nanospheres[J].Arch Biochem Biophys，1999，361：47-56.
推荐访问： 转染 磷酸钙 疫苗 纳米 载体