摘要：采用低温液体富集、酪蛋白筛选平板、温度复筛等方法从黑龙江省大庆油田土壤这一非极端自然环境中筛选分离获得2株产低温蛋白酶的耐冷细菌LS3和LS4，通过菌落形态和显微观察，结合16S rDNA全序列分析确定前者为假单胞菌属（Pseudomonas），后者为微小杆菌属（Exiguobacterium）。LS3和LS4菌株在低温（10 ℃）下均能较好地生长及产酶，最适酶活温度分别为40、30 ℃，最适作用pH值均为8，对热敏感，低温仍能维持较好的酶活，属于低温碱性蛋白酶。其中，LS3菌株在含尿素培养基中产酶活性较高（52.46 U/mL），LS4菌株产的蛋白酶对盐有一定耐受性。本研究结果丰富了对低温蛋白酶的研究开发，为其在食品工业、农业复合菌剂等领域的应用提供了基础。
关键词：耐冷菌株；低温蛋白酶；酶学性质
中图分类号：S182；Q814.1文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2017）10-0209-04
微生物的生命活动和温度密切相关，可分为高温、中温和低温微生物三大类。Morita将低温微生物分为嗜冷菌（psychophile）和耐冷菌（psychrotroph），前者最低可低于0生长，最高生长温度约20 ℃，最适生长温度不超过15 ℃；后者最适温度可高于15 ℃，最高生长温度大于20 ℃，在0～5 ℃可生长繁殖[1]，该定义已被广泛接受。James等在《Modern Food Microbiology》一书中提出，耐冷菌又有狭义（stenopsychrotroph，40 ℃不生长）和广义（eurypsychrotroph，可高于40 ℃生长）之分[2-3]。这些低温微生物是低温酶（cold-active enzyme or psychrophilic enzyme）来源的重要资源库。蛋白酶是目前应用最多的一种酶，占世界酶市场的60%以上[4]。低温蛋白酶最适作用温度一般比同功能的中温蛋白酶（50 ℃）低20～30 ℃，在低温（0～20 ℃）和中温环境下均具有较高催化活性，且对热不稳定，因而有着中温蛋白酶无法取代的优越性[5]，已被广泛应用于分子生物技术、环境生物修复、食品工业、医药行业等各大领域[6]。已报道的产低温蛋白酶的微生物大多分离自两极、深海、冰川、冻土等常冷环境[7-10]。本研究对大庆油田土壤样品中微生物进行分离筛选，得到2株产低温碱性蛋白酶的耐冷菌，即狭义耐冷菌LS3和广义耐冷菌LS4，经鉴定分别属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.）和微小杆菌（Exiguobacterium sp.），并进一步对粗酶液进行酶学性质研究，为低温蛋白酶的广泛应用提供基础。
1材料与方法
1.1菌株来源及培养基
1.1.1菌株来源
土壤样品来自黑龙江省大庆油田，为无结核硅质黏土，颜色较黑，质地较硬。
1.1.2培养基
（1）LB富集培养基。蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，调pH值至7.0～7.2。固体培养基另加15～20 g/L琼脂粉。（2）初筛培养基。酪蛋白 10 g/L，蛋白胨0.5 g/L，酵母提取物0.3 g/L，琼脂粉1.5%～2.0%，调pH值至7.0～8.0。（3）摇瓶发酵培养基。酪蛋白10 g/L，蛋白胨0.5 g/L，酵母提取物0.3 g/L，调pH值至 7.0～8.0。
1.2产低温蛋白酶耐冷菌株的筛选及鉴定
1.2.1耐冷菌富集5 g土壤样品加入45 mL无菌水，充分搅拌后静置30 min浸出，取土壤浸出液于LB培养基中，于 10 ℃、130 r/min富集培养并如此转接富集3～4次，以上所有过程均在无菌条件下完成。
1.2.2产低温蛋白酶耐冷菌株初筛将富集菌液按梯度稀释法取合适稀释度移入初筛平板中，涂布均匀，10 ℃倒置培养，挑选透明圈较大、菌落直径较大的菌株继续涂布或划线直至菌落形状完全一致。
1.2.3产低温蛋白酶耐冷菌株温度复筛以43 ℃为生长上限温度，该温度下即不生长的菌株为耐冷菌，如前所述40 ℃用于区分狭义和广义耐冷菌[2-3]。将初筛得到的产蛋白酶菌株在初筛平板上点樣，分别置于4、20、37、43 ℃上培养，4 ℃生长、43 ℃下不生长的菌株为试验菌株，液体培养后加灭菌甘油于-70 ℃下保存。
1.2.4蛋白酶活力测定按照QB/T 1803—1993《工业酶制剂通用试验方法》的紫外分光光度法测定粗酶液酶活力。20 g/L 酪蛋白底物用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液配制，相应温度下反应30 min后加0.4 mol/L三氯乙酸终止反应，12 000 r/min 离心10 min，取上清液，275 nm处测定吸光度D值。酶活力定义为：在上述条件下，1 mL酶液催化酪蛋白水解形成1 μg酪氨酸的酶量为1个单位（U/mL）。
1.2.516S rDNA全序列测序细菌克隆测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。通用引物为：7F，5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；1540R，5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。
1.3菌株生长产酶特性
1.3.1温度对产酶耐冷菌生长的影响将产酶菌株的液体培养液按2%的接种量接入10 mL LB富集培养基中，分别置于4、10、20、25、30、37、40、43 ℃下130 r/min下振荡培养，每隔 2 h 测其D600 nm值。
1.3.2pH值对产酶耐冷菌生长的影响同“1.3.1”节接种，于30 ℃、130 r/min下振荡培养，调节培养基pH值分别为5、6、7、8、9，每隔2 h测其D600 nm值。
1.3.3盐度对产酶耐冷菌生长的影响同“1.3.2”节接种培养，调节培养基NaCl浓度分别为0、5、10、20、30、40、50、60、70 g/L，每隔2 h测其D600 nm值。
1.3.4培养时间对菌株生长及产酶影响将产酶菌株的液体培养液按2%的接种量接入50 mL发酵培养基中，于 10 ℃、130 r/min下振荡培养，每24 h测其D600 nm 值及上清液酶活力。
1.3.5不同碳源、氮源对耐冷菌生长及产酶影响
1.3.5.1碳源试验以酪蛋白为氮源，在培养基中分别加入葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉和酵母膏为碳源，使终浓度为10 g/L，培养96 h后测酶活力。
1.3.5.2氮源试验以酵母膏为碳源，在培养基中分别加入胰蛋白胨、尿素、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵和酪蛋白为氮源，使终浓度为5 g/L，培养96 h后测上清液酶活力。
1.4粗酶液部分酶学性质研究
1.4.1酶的最适温度将酶活力测定中的反应温度分别控制在10、20、30、40、50、60 ℃，其他條件不变，分别测定酶活力。
1.4.2酶的最适pH值在最适反应温度下，将酶活力测定中的反应pH值分别控制在7、8、9、10、11，其他条件不变，分别测定酶活力。
1.4.3酶的热稳定性将粗酶液分别在30、40、50、60 ℃ 等4个温度下保温10、20、30、40 min，再放入冰水混合物中冷却，测定蛋白酶活力，以未做保温处理的酶活力为对照。
1.4.4酶的耐盐性在酶的最佳反应温度和pH值条件下，于酶反应体系中分别加入0、10、20、30、40、50 g/L NaCl，以未加NaCl的酶活力为100%，分别测定酶活力。
1.4.5部分金属离子及抑制剂对酶活力的影响在酶的最佳反应温度和pH值条件下，于酶反应体系中加入不同金属离子及抑制剂，以未加金属离子或抑制剂的酶活力为100%，测定加入化学剂后的酶活力。
2结果与分析
2.1产低温蛋白酶耐冷菌株的筛选和鉴定
经过低温富集、平板初筛、温度复筛及酶活力检测，从土壤样品中筛选得产蛋白酶活力较高的耐冷菌LS3和LS4。LS3菌株呈细长杆状，长约2 μm，宽约0.5 μm；LS4菌株呈粗短杆状，长不到1 μm，宽约0.8 μm（图1）。在酪蛋白平板上，两菌均呈圆形，不透明，表面光滑、边缘整齐、易挑取，产生明显透明圈，其中LS3为乳白色，LS4呈土黄色。经16S rDNA [CM（23*5]全序列测序鉴定，乳白色LS3菌株为假单胞菌属，土黄
色LS4菌株为微小杆菌属。
2.2菌株生长产酶特性
2.2.1温度、pH值及盐浓度对菌株生长的影响2株菌株在不同温度、pH值及盐浓度培养条件下的生长情况不同。LS3和LS4在低温（4、10 ℃）下生长状态较好，LS3在33 ℃不生长，符合狭义耐冷菌的定义，而LS4在43 ℃下不生长，为广义耐冷菌。2株菌株对pH值均有一定耐受性，LS3在pH值为6～8之间生长良好，LS4在pH值为5～8之间生长良好，pH值达到9时对2株菌株生长稍有不利。LS3在0～20 g/L盐浓度范围内生长状态良好，在盐浓度超过30 g/L以后随着盐度升高，菌株生长逐渐受到抑制，当盐浓度为50 g/L时即不生长，在60 g/L以上时D值呈下降趋势，因为在该条件下，耐冷菌受到高渗胁迫，胞内失水，细胞凋亡。LS4菌株的耐盐性与LS3相似，但其在不含盐条件下生长也会受到抑制，在盐浓度为50 g/L时也能生长，只是在高盐环境下生长受阻而十分缓慢。
2.2.2培养时间对菌株生长及产酶的影响2株菌株在 10 ℃ 下生长和产蛋白酶曲线（酶反应温度为10 ℃）结果见图2。由图2可知，2株菌株在60 h前处于对数生长期，后进入一段较长时间的稳定期，且酶活力在达到稳定期之前呈直线上升趋势，之后也渐趋于稳定。培养液中蛋白酶量与菌体生物量呈正相关关系，当菌体生长进入对数生长后期时，菌株开始大量合成蛋白酶并分泌至胞外，随后酶继续产生，培养液中酶活力迅速升高；当菌体生长达稳定期后，培养液中酶活力保持基本恒定，并能维持较长时间。
2.2.3不同碳源和氮源对耐冷菌生长及产酶的影响利用不同碳源和氮源对LS3与LS4等2株耐冷菌进行发酵培养，其生長及产酶情况分别见表1、表2。由表1可知，2株菌株均不能在含葡萄糖的液体培养基中生长；对麦芽糖和可溶性淀粉利用率很低，酶活力极低或没有酶活力；能较好地利用蔗糖，且有较高酶活力；在含酵母膏的液体培养基中生长最旺盛，但就酶活力而言，LS3菌株利用酵母膏的产酶情况不及蔗糖，LS4菌株利用酵母膏和蔗糖的产酶情况相当。由表2可知，在所试7种氮源中，LS4菌株虽能利用不同氮源生长，但仅在酪蛋白的存在下才产生蛋白酶，可认为其分泌的蛋白酶是诱导酶而非组成酶。LS3菌株与LS4菌株相似，但除了酪蛋白，其还能更好地利用尿素分泌蛋白酶，酶活力达到 52.46 U/mL。
2.3粗酶液部分的酶学性质
2.3.1酶的最适温度设置不同的温度梯度，对菌株酶活力进行检测。图3显示，狭义耐冷菌LS3产蛋白酶的最适作用温度约在40 ℃，50 ℃仍维持95%左右的酶活力，而在60 ℃降到50%左右，且在10、20 ℃维持较高酶活力，分别为40%、55%左右。广义耐冷菌LS4产蛋白酶的最适作用温度较LS3的低，在30 ℃左右，在10、20 ℃下分别维持45%、60%左右的较高酶活力，60 ℃高温下仅存最高酶活力的25%左右。根据Margesin等的定义，通常把最适作用温度在35 ℃左右的低温下仍具一定催化效率的酶称为低温酶[11]。已报道的由耐冷菌分泌的蛋白酶最适作用温度一般处在25～50 ℃范围[12]。已知耐冷菌产蛋白酶的最适作用温度最低的为19℃[13]，也有更高的最适温度（55～60 ℃）[14-16]，可视为中温酶。由此表明，耐冷菌所产酶不一定都是低温酶，要鉴定是否为产低温蛋白酶的菌株，也须要比较所产蛋白酶在不同温度下的酶活力以及酶的热稳定性。
2.3.2酶的最适pH值设置不同的pH值梯度，对菌株酶活力进行检测，结果见图4。2株菌株最适作用pH值均在8左右，LS3菌株所产蛋白酶在碱性环境（pH值为8～11）下维持较高酶活力，虽呈递减趋势，但pH值在11时仍保持最高酶活力的60%左右。而LS4菌株所产蛋白酶活力受pH值影响较大，随pH值升高，酶活力迅速下降，pH值为11时仅为最高酶活力的15%左右。2株菌株所產低温蛋白酶均为碱性蛋白酶。
2.3.3酶的热稳定性蛋白酶的耐热性检测试验结果显示，LS3和LS4等2株菌株所产生的蛋白酶对热的稳定性不同（图5）。30 ℃保温处理对LS3菌株产生的蛋白酶影响不大，该温度下保温40 min后仍持有65%左右的活性；40 ℃处理30 min，50 ℃保温10 min后仍保持60%左右，但50 ℃处理 20 min 则几乎丧失100%的酶活力。相对LS3而言，LS4菌株产生的蛋白酶对热更不稳定，其在30 ℃保温30 min之后即丧失45%左右的活力，40 min后仅剩30%左右；40 ℃保温 10 min 之后则只剩50%左右的酶活力，40 ℃处理30 min，50 ℃ 处理10 min即丧失所有酶活力。LS3和LS4等2株菌株产生的蛋白酶对热的稳定性不同，应该与酶的最适作用温度有关，前者为40 ℃左右，后者约为30 ℃，所以LS4菌株产生的蛋白酶热稳定性更差。总而言之，2株菌株所产生的蛋白酶均对热不稳定，在较高温度（>50 ℃）下可快速失活，这是低温酶的一个重要特性。
2.3.4酶的耐盐性由图6可知，盐浓度对蛋白酶活力影响较为明显，尤其是对LS3菌株产生的蛋白酶而言，盐浓度为10 g/L时即可抑制50%左右的酶活力，盐浓度为30 g/L时几乎丧失100%的酶活力。LS4菌株产生的蛋白酶对盐有一定耐受能力，盐浓度为10 g/L时仍保持70%左右的酶活力，盐浓度为40 g/L时保持15%左右的酶活力。
2.3.5部分金属离子及抑制剂对酶活力的影响金属离子对酶活力的影响与酶的特殊结构有关，研究金属离子对酶活力的影响在今后的理论及应用研究中都具有重要的意义。由表3可知，受试金属离子对LS3菌株产蛋白酶的活力均有一定程度的抑制作用，Mg2+、K+、Ba2+浓度的抑制作用没有Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+浓度的抑制作用明显，而Mg2+、K+浓度对LS4菌株产生的蛋白酶无明显影响，Cu2+、Zn2+浓度则会[CM（25]使蛋白酶完全失活。吐温80对2个蛋白酶均有明显的激
活效果，其中机理尚不清楚。已有研究表明，吐温80可在蛋白药物中用作稳定剂，起保护作用，防止蛋白质分子之间发生反应或吸附聚集[17]。变性剂十二烷基硫酸钠（SDS）对2株菌株的蛋白酶均有强烈的抑制作用，使蛋白酶的氢键、疏水键打开并插入其疏水内部，形成蛋白酶-SDS复合物，从而使酶失活。研究表明，二甲基亚砜（DMSO）存在一定的毒性作用，与蛋白质疏水基团发生作用，能导致蛋白质变性。然而试验显示，DMSO对蛋白酶无抑制作用且对LS4菌株产生的蛋白酶有激活作用（136%），其中机理有待进一步探究。β-巯基乙醇对2株菌株產蛋白酶均有明显的抑制作用，其通过将蛋白酶中二硫键还原为—SH基团而使之失活。金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）对LS4产的蛋白酶有强烈的抑制作用，对LS3产的蛋白酶无影响，说明LS4产的蛋白酶属于金属蛋白酶。
3结论
本试验从大庆油田土壤这一非极端自然环境中分离获得2株产低温碱性蛋白酶的耐冷菌株LS3、LS4，丰富了产低温碱性蛋白酶耐冷菌的资源库。菌株对pH值（5～9）及盐浓度（0～4%）均有一定耐受性。LS3菌株为狭义耐冷菌，经鉴定为假单胞菌属，LS4菌株为广义耐冷菌，经鉴定为微小杆菌属。2株菌株在低温下能够良好生长并产酶，在尿素存在下，LS3产酶活力达到52.46 U/mL，为投入实际应用提供了有力依据，是良好的出发菌种。LS3和LS4菌株所产酶的最适作用温度分别为40、30 ℃左右，最适作用pH值为8左右，低温碱性环境中蛋白酶均维持较高活性，而热稳定性差，在较高温度（>50 ℃）下快速失活，为蛋白酶的应用提供基本条件。金属离子对LS3菌株产蛋白酶的活力均有一定程度的抑制作用，Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+浓度的抑制作用较为明显，表明此蛋白酶的作用不需要金属离子的参与，EDTA对其无影响也可证实这一点。Cu2+、Zn2+浓度可使LS4菌株产的蛋白酶完全失活，其对EDTA敏感，说明属于金属蛋白酶。而吐温80作为稳定剂，对2个蛋白酶均有激活效果。该研究对蛋白酶的实际应用具有指导性意义。
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