摘 要：該研究以广西特色柿品种‘恭城月柿’为材料，在采后贮藏过程中对其氧化还原电位（ORP）、乙烯生物合成量、硬度、色差、抗氧化酶及细胞壁降解酶活性的变化进行了测定，初步探讨柿果实氧化还原电位与乙烯生物合成和相关酶活性的关系。结果表明：贮藏期果实的硬度整体呈下降趋势，乙烯利处理果实的硬度从采后3 d即急速下降，至贮藏末期始终显著低于对照。贮藏前14 d果实转色较缓慢，采后15 d乙烯利处理果实的总色差ΔE值快速上升至29.6，转色完全，显著高于对照的11.9。在贮藏前期处理和对照果实的ORP均稳定在7.5 mv·g-1，采后15 d乙烯利处理果实的ORP快速上升至11.9 mv·g-1，是对照组的1.4倍。乙烯利处理果实的乙烯生物合成量在贮藏前期呈较低水平，采后15 d乙烯生成量急剧增加至0.372 μL·kg-1·h-1的高峰，对照乙烯生成量则始终维持在0.033 μL·kg-1·h-1的较低水平。可见，乙烯生成量的增加与ORP的上升关系密切。此外，抗氧化酶中的过氧化物酶（POD）和细胞壁降解酶中的β-D-半乳糖苷酶（β-D-Gal）活性与ORP呈极显著正相关，表明二者受果实ORP变化的影响。因此，经乙烯利处理柿果实的ORP贮藏末期显著上升，促进乙烯生物合成量的急剧增加，诱导抗氧化酶POD和细胞壁降解酶 β-D-Gal活性增强，导致果实急速后熟软化。柿果实ORP可能作为开关调控1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）生成乙烯这一生物化学反应，即打破ORP的稳定状态引发乙烯合成的启动。
关键词：柿，氧化还原电位，乙烯，酶活性，软化，保鲜
中图分类号：Q945
文献标识码：A
文章编号：1000-3142（2018）10-1326-09
Abstract：Ethylene is a common plant hormone which can accelerate the ripening of fruits. Post-harvest ripening involves a variety of complex metabolic processes such as ethylene biosynthesis，reactive oxygen species biosynthesis and cell wall degradation hydrolyses. ‘Gongcheng’ persimmon is a distinctive variety of Guangxi Zhuang Autonomous Region，and was used as the research material to determine the changes of indexes e.g.，oxidation reduction potential（ORP），ethylene biosynthesis，firmness，total chromatism，and related enzyme activities during the storing experiment. The results demonstrated that firmness decreased continuously during the whole storing period，the firmness of fruits were treated with ethephon were declining rapidly during the first three days of storage，and were significantly lower than the control at all times. During the first fourteen days of storage，the total color chromatism was rising slowly. Fifteen days after harvest，the color of fruits，which were treated with ethephon，had changed completely and delta E value rapidly increased to the maximum of 29.6 which is evidently higher than that of the control 11.9. The ORP changed within a smaller range and maintained at 7.5 mv·g-1 in the prophase of storage. Fifteen days after harvest，the ORP of fruits which were treated with ethephon increased rapidly to 11.9 mv·g-1，1.4 times as much as that of the control. Additionally，ethylene biosynthesis did not change significantly during the first fourteen days. However，from the fifteenth days after harvest，the ethylene biosynthesis rate of fruits were treated with ethephon increased sharply to 0.372 μL·kg-1·h-1 and reached the maximum，but the control kept at a stable level of 0.033 μL·kg-1·h-1. Thus，the increase of ethylene biosynthesis was closely related to the rise of ORP. Furthermore，the activity of peroxidase（POD） belonging to the antioxidative enzymes and β-D-galactosidase（β-D-Gal） belonging to the cell wall degrading enzymes were also significantly and positively correlated to ORP，indicating that POD and β-D-Gal activities are affected by the ORP. Therefore，the ORP of persimmon fruits treated with ethephon increased observably at the end of storage，promoting a sharp biosynthesize of ethylene，increasing activities of POD and β-D-Gal，and finally resulting in the rapid softening and ripening of persimmon. It is proved that persimmon fruit ORP may act as a switch to control the biochemical reaction of ethylene biosynthesis，and breaking the ORP steady state can initiate ethylene synthesis.
Key words：persimmon，oxidation reduction potential，ethylene，enzyme activity，soften，retain freshness
‘恭城月柿’是我国广西的特色涩柿品种，存在着涩与甜、脆与软的矛盾（王华瑞等，2004），采后脱涩处理导致的物理和化学伤害促进了果实的成熟软化，从而影响其品质和货架期（Yin et al，2012）。因此，贮藏期间果实的快速成熟软化严重制约了广西柿产业的发展。柿果实属于呼吸跃变型果实，对乙烯极为敏感，贮藏环境中极微量的乙烯便可诱导其产生内源乙烯从而导致其后熟软化（Itamura，1986; Itamura et al，1991）。部分跃变型水果成熟期在树上不易成熟，一旦与树体脱离则迅速进入呼吸跃变期（Burg & Burg，1962）。Sun et al（2009，2010，2013）研究发现柿果实着生树体期间乙烯合成的启动由韧皮部的“光合产物流因子”和木质部的“水因子”共同控制，切断任何一个途径都能诱导果实内源乙烯的大量生成。采后研究中，水分胁迫通过诱导启动果蒂的乙烯合成，进一步促发果实的乙烯自动催化反应在柿果实中已得到证实（Nakano et al，2001，2002，2003）。但外源抗氧化剂（维生素C）可以明显抑制采后柿（范灵姣等，2017）和猕猴桃（Yin et al，2013）乙烯合成前体物（ACC）积累和关键酶（ACS、ACO）活性增加，进而减少内源乙烯生成。外投抗氧化剂会影响机体的氧化还原电位（ORP）及相关抗氧化指标（尹守铮，2010;王俊等，2016）。ORP表征机体中氧化还原状态的相对强弱（向交等，2014），其在机体中过高或过低，都会导致应激及相关代谢的启动进而加快衰老（廖鹏等，2006）。
目前，国内外对ORP的研究较多地关注水体、土壤及发酵工业的环境监测等领域，关于果实采后ORP变化与其成熟软化的关系还未见报道。本研究通过研究柿果实采后贮藏过程中氧化还原电位、乙烯生物合成量、抗氧化酶以及细胞壁降解酶之间的关系，探讨氧化还原电位在其后熟软化中的作用，为果实采后保鲜技术提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料和处理
供试品种为‘恭城月柿’。2016年10月29日在广西桂林市恭城县采摘果实，采摘后当日运回广西大学园艺系实验室。挑选大小一致（180 ～ 200 g）、色泽均匀、成熟度一致、无病虫害且无机械损伤的果实，贮藏于冷库中用于试验，温度为25 ℃（变幅控制在1 ℃以内），相对湿度为60%～70%。试验贮藏时间为2016年10月29日至11月13日。
试验共设两个处理，每个处理用果量为350个。乙烯利处理，即先用1 000 mg·L-1的乙烯利溶液浸泡柿果实5 min后于阴凉处通风晾干果实表面的水分，然后于密封袋（80 cm × 80 cm）中密封处理24 h后置于冷库中进行贮藏;去离子水处理为对照。每3 d对果实相关指标进行测定，并切取赤道部果肉，液氮速冻后于-80 ℃保存备用。
1.2 测定指标与方法
1.2.1 硬度和总色差的测定 硬度的测定参照Wang et al（2010）的方法，每个处理随机选取12个果实，在果实赤道部相反方向的两面削去小块果皮后，用质构仪TA.XT.plus（英国，Stable Micro Systems公司）进行穿刺，穿刺探头为C002ST（直径5 mm圆柱形探头），深度为10 mm ，速度为1.5 mm·s-1。每个处理每次测定均进行3次生物学重复，每个重复4个果。
总色差的测定参照范灵姣等（2017）的方法，每个处理随机选取9个果，用GR-10色差计（日本，KONICA MINOLTA公司）对果实赤道部随机进行一次测定，每个处理每次测定均进行3次生物学重复，每个重复3个果。
1.2.2 氧化还原电位的测定 ORP测定参照Chen et al（2005）的方法并做部分改良。每个处理随机选取12个果，每个果取赤道部果肉10 g制作切片（=12 mm，δ=5 mm），置于150 mL的磷酸缓冲液（0.1 mol·L-1，pH7.0）中30 min，濾纸过滤后，用经醌氢醌饱和溶液标定后的金属铂电极600s-ORP（美国，JENCO公司）进行测定，时间为2 min。每个处理每次测定均进行3次生物学重复，每个重复4个果。
1.2.3 乙烯生物合成量的测定 每个处理随机选取5个果实置于4 L密封容器中，25 ℃环境下密封6 h，用注射器采集5管（每管5 mL）顶空气体，采用气相色谱仪GC-17A（日本，Shimadzu公司）进行测定，GC条件为色谱柱：固定相为Porapak Q的不锈钢填充柱[2 m × 3 mm（od）];检测器：氢火焰离子化检测器（FID）;气体为载气：N2（流速50 mL·min-1），燃气：H2（30 mL·min-1），助燃气：空气（300 mL·min-1）;检测温度为检测器：200 ℃，进样口：110 ℃，色谱柱：90 ℃;微量注射器手动进样（美国，Hamilton公司），进样量为1 000 μL。
1.2.4 酶液制备及酶活性测定 过氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）酶液的制备参照Aebi（1984）和Chance & Meahly（1995）的方法略加改进，取果肉 3.0 g，液氮研磨，加入 5.0 mL提取缓冲液（0.1 mol·L-1磷酸缓冲液，pH7.8;5 mmol·L-1 DTT;5% PVP）摇匀，4 ℃离心30 min，取上清液用于酶活性的测定。酶活性的测定采用比色法，SOD参照Li et al（2016）的方法进行，CAT和POD参照Khademi et al（2014）的方法进行。
多聚半乳糖醛酸酶（PG）、纤维素酶（Cx）、β-D-半乳糖苷酶（β-D-Gal）酶液的制备参照Andrews & Li（1995）和 Zhou et al（1999）的方法略加改进。取果肉3.0 g，液氮研磨，加 6.0 mL 0.2 % 硫酸钠溶液摇匀，4 ℃离心15 min，弃上清液加入 6 mL 100 mmol·L-1的醋酸钠缓冲液（内含 100 mmol·L-1NaAc，1%（V/V）巰基乙醇，1.5% PVP（K-30），pH 5.2，置冰槽中摇匀，4 ℃离心30 min，上清液用于酶活性测定。PG活性测定按照Jiang et al（2010）的方法，Cx活性测定采用3，5-二硝基水杨酸法（Opiyol & Ying，2010），β-D-Gal活性测定按照Itamura et al（2013）的方法。以上生理指标的测定，每个处理每次测定均进行3次生物学重复，每个重复4个果。
1.3 数据处理
采用Excel 2010（美国，Microsoft公司）和SPSS 17.0软件（中国，IBM SPSS公司）进行数据的作图、分析和统计，采用最小显著差异法（LSD）进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 柿果实贮藏期间硬度和总色差的变化
采后果实硬度和颜色变化直观反映其成熟的变化状态。图1：A显示，贮藏期果实的硬度整体呈下降趋势，乙烯利处理组果实从采后3 d即急速下降，由起始的13.2 N降低至9.96 N，至贮藏末期始终显著低于对照，对照果实软化进程缓慢。图1：B显示，果实总色差值ΔE贮藏期间呈上升趋势，乙烯利处理组果实的ΔE值贮藏前14 d变化较小，果实转色比较缓慢，采后15 d，ΔE值快速升高至29.6，转色完全，显著高于对照（11.9）。由此可见，乙烯利处理加快了果实软化和转色，促进了果实的后熟。
2.2 柿果实贮藏期间氧化还原电位和乙烯生物合成量的变化
ORP表征果实的氧化还原状态如图2：A所示，贮藏期果实的ORP在前14 d稳定在7.6 mv·g-1，采后15 d，乙烯利处理组果实ORP快速升高至11.9 mv·g-1，显著高于对照的8.7 mv·g-1。乙烯是五大植物激素之一，能够加快果实的成熟。从图2：B可以看出，贮藏期乙烯利处理组果实的乙烯生物合成量始终高于对照组，采后15 d，乙烯生成量急剧增加至0.372 μL·kg-1·h-1的高峰，对照乙烯生成量则维持在0.033 μL·kg-1·h-1。贮藏期果实的ORP与乙烯生物合成量呈极显著正相关（表1），这表明果实乙烯生成量增加与ORP上升关系密切。
2.3 柿果实贮藏期间抗氧化酶的变化
SOD、CAT、POD是活性氧代谢系统中的重要酶系统，可以清除果实内活性氧从而延缓其成熟衰老。从图3可以看出，乙烯利处理果实的抗氧化酶活性整体高于对照。贮藏期果实SOD活性整体呈下降趋势，采后15 d，乙烯利处理组果实的SOD活性从起始的5.25 U·min-1·g-1降低至4.6 U·min-1·g-1，高于对照的3.56 U·min-1·g-1。图3：B-C显示，乙烯利处理组果实的CAT活性在贮藏前9 d变化较小，采后9～15 d，CAT活性有一个急剧上升-下降的变化趋势，其中在第14天达到最大值347.47 U·min-1·g-1，对照组CAT活性稳定在7.9 U·min-1·g-1。更有意思的是贮藏前14 d，果实的POD活性在0.035 U·min-1·g-1以下且无明显变化，采后15 d，乙烯利处理组果实的POD活性急速上升至0.504 U·min-1·g-1，显著高于对照0.005 U·min-1·g-1。贮藏期间，柿果实SOD和CAT活性与ORP、乙烯生成量、硬度和总色差的相关性不显著，但POD活性与ORP、乙烯生成量和色差呈极显著正相关，与果实硬度呈显著负相关（表1），说明整个贮藏期，POD活性的升高与ORP升高、乙烯生物合成量增加以及果实的成熟软化关系密切。
2.4 柿果实贮藏期间细胞壁降解酶的变化
PG、Cx和 β-D-Gal是促进细胞壁组分水解，调控果实成熟软化的关键酶。图4：A-B显示，贮藏期PG活性整体呈先上升后下降的变化趋势，乙烯利处理组果实的PG活性始终稍高于对照组，乙烯利处理组果实的Cx活性与对照果实无明显差异。从图4：C可以看出，贮藏期果实的 β-D-Gal活性整体呈上升趋势，乙烯利处理组果实的 β-D-Gal活性在贮藏前14 d变化较小，采后15 d，β-D-Gal活性急速上升至最大值60.64 μmol·min-1·g-1，至贮藏末期始终显著高于对照。贮藏期果实的PG和 β-D-Gal活性与硬度呈显著负相关，β-D-Gal活性与ORP、乙烯生物合成量和总色差呈极显著正相关（表1），由此可见，β-D-Gal活性的升高与ORP升高、乙烯生物合成量增加以及果实的成熟软化关系密切。
3 讨论与结论
植物激素乙烯被证实是促进调控果实成熟软化和衰老的重要因子，人工合成乙烯利遇水释放乙烯气体，广泛用于跃变型果实的人工催熟，如香蕉（郭斐，2016）、菠萝蜜（王俊宁等，2014）、番茄（徐爱东，2011）、樱桃（Khorshidi & Davarynejad，2010）、梨（Choi et al，2013）、无花果（李春丽和沈元月，2016）等水果。本研究发现，乙烯利处理显著促进果实硬度下降和总色差升高，催熟作用明显，同时乙烯利处理果实的乙烯生成量急剧增加。贮藏期，乙烯生成量与果实硬度呈显著负相关，与总色差呈极显著正相关。验证了乙烯是调控柿果实成熟软化的关键因素。
氧化还原电位（ORP）代表机体氧化还原状态的相对强弱（向交等，2014），表征氧化还原反应的自由能和反应的方向（Gibbs，1873）。氧化还原反应由两个半反应组成，即氧化半反应和还原半反应，每个半反应都有其对应的电位（Boyer，2002）。在生命体中，呼吸作用及各种代谢途径都离不开氧化还原反应，它不仅为生物提供能量，还决定生命体的衰老和死亡（董亮等，2013）。而果实乙烯合成过程中，ACC与O2由ACC氧化酶（ACO）生成乙烯（C2H4）本质上是一个氧化还原反应，电子传递和氧化还原状态的不断变化影响其反应的进行方向。本研究中，柿果实ORP在贮藏前14 d相
对稳定，采后15 d，乙烯利处理组ORP快速上升显著高于对照，同时伴随乙烯的大量生成，果实ORP与乙烯生成量呈极显著正相关。这表明柿果实贮藏期，乙烯合成与ORP稳定状态之间关系密切，ORP可能作为开关调控ACC生成乙烯这一生物化学反应，即打破ORP的稳定状态引发乙烯合成的启动，进而加快果实后熟。
细胞内存在着一套完整的氧化系统和还原系统。正常情况下，二者处于有机平衡，细胞功能正常。一旦二者失衡，就会导致应激反应，进而加快衰老（Gerontol，1956）。植物在正常的代谢活动中会产生超氧阴离子（O-2·）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（·OH）等活性氧（ROS）（Li et al，2016），ROS是打破细胞内氧化系统与还原系统之间动态平衡的主要因素。而SOD、CAT、POD是生物体内活性氧防御系统的重要酶系统，可以清除组织中ROS，减少ROS积累对细胞造成的伤害，从而延缓衰老（王成涛等，2011）。本研究发现，抗氧化酶中SOD活性在整个贮藏期维持较高水平无显著变化，而CAT和POD活性在贮藏前期活性维持在较低水平，且POD活性与ORP呈极显著正相关。这表明，SOD对果实内ROS的清除作用贯穿整个贮藏期，对维持细胞内氧化还原动态平衡起重要作用。而CAT和POD对ROS的清除作用，可能在H2O2积累到一定水平后才启动，且CAT作用时间早于POD。SOD、CAT、POD的协同作用通过维持ORP相对稳定，达到延缓果实快速衰老软化的目的。同时，POD活性上升与ORP稳定状态密切相关，果实内ORP稳定状态打破可能是诱导POD活性快速上升的主要原因。
细胞壁降解是导致果实软化的直接原因。一系列细胞壁降解酶（PG、Cx、β-D-Gal等）的相互作用，使得细胞中胶层结构发生改变，细胞壁物质降解，细胞壁整体结构最终被破坏（Huber，1983）。PG和Cx促进果实软化的作用在蓝果忍冬（赵丽娟，2016）、西瓜（刘景安等，2013）、苹果（刘超超等，2011）等果实中已经得到证实。齐秀东等（2015）发现，不耐贮藏的‘京白梨’果实中，β-D-Gal相比PG和Cx与其成熟软化存在着更为密切的关系。这一结果在草莓（薛炳烨等，2006）、桃（阚娟等，2012）和番茄（Gross & Wallner，1979）等果实中也有过类似报道。本研究中，β-D-Gal活性与硬度呈极显著负相关，与乙烯生成量、总色差呈极显著正相关，其与乙烯生成量、硬度和总色差的相关度远大于PG和Cx，这与齐秀东等（2015）在梨果实中研究的结果相一致。同时，β-D-Gal活性与ORP呈极显著正相关，表明贮藏期，β-D-Gal活性受ORP变化的影响，ORP上升诱导其活性的增加，从而促进细胞壁降解，加快果实软化进程。
综上所述，氧化還原电位在柿果实后熟软化过程中起关键作用。外源乙烯通过打破果实内氧化还原电位的稳定状态，引发自身乙烯合成的启动，促进内源乙烯大量生成，诱导抗氧化酶POD和细胞壁降解酶β-D-Gal活性增强，从而加快贮藏期果实的后熟衰老进程。
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