材料与方法
1.1 材料准备
从南京师范大学泰州学院微生物实验室分离一株高温木质素分解菌，已进行16S rDNA测序，确定为假单胞菌属的绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa，编号M-2）。从斜面中挑取一环接种到LB液体培养基中，55℃条件下摇床活化48h，然后取1mL菌悬液接种到LB液体培养基中，培养至OD600值为0.6制备种子液，备用。LB（产酶培养基）培养基配方为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加热至溶解，用NaOH调pH至7.0，加去离子水定容至1L，并在121℃高压下蒸汽灭菌30 min。
1.2 单因素试验设计
（1）碳源优化：在产酶培养基中以秸秆、葡萄糖、玉米粉、木质素、淀粉（10g/L）为碳源，将种子液按1%的接种量接入培养基中，55℃，160 r/min振荡培养48 h，进行漆酶活力测定；
（2）氮源优化：在确定最佳碳源后，固定碳源，以酒石酸铵、酵母提取物、蛋白胨、硫酸铵、牛肉膏（5g/L）为氮源。将种子液按1%接种量接种，55℃，160 r/min振荡培养48 h，进行漆酶活力测定。
（3）初始pH值：在确定最佳碳源、氮源后，将发酵基础培养基的初始pH值分别调为4、5、6、7、8、9，将种子液按1%的接种量进行接种，55℃，160 r/min振荡培养48 h，进行漆酶活力测定。
（4）培养温度：在确定了最佳碳氮源、氮源、初始pH值条件下，设置菌株的发酵温度分别为40、45、50、55、60℃，并按照1%的接种量进行接种，55℃，160 r/min振荡培养48 h，进行漆酶活力测定。
（5）发酵时间：对以上各因素优化后，选择最佳的培养条件，将种子液同样按照1%的接种量进行接种，160 r/min振荡培养24 h后，每隔12 h取样进行漆酶活力测定。
1.3 测定项目与方法
培养结束后，取适量的培养液，在4000 r/min条件下，离心10min，取上清液进行漆酶的测定。测定方法为：20 mL 的反应体系中加入18.6 mL 的50 mmoL/L 的乙酸- 乙酸钠缓冲液（pH 4.5），将其在25℃预热10 min 后，加入0.4 mL 的10 mmoL/L的愈创木酚和1 mL的粗酶液，在反应温度为25℃时，测定465 nm处吸光度的增加。
酶活力定义为：每分钟内氧化1.0 μmol的愈创木酚所需酶量为一个酶活力单位。
1.4 数据处理
用Excel2007对试验数据进行基本计算，SPSS18.0进行统计分析，不同处理间的差异显著性用单因素方差分析进行比较。
2 结果与分析
2.1 碳源对发酵液中漆酶活性的影响
在设置不同碳源，将种子液按1%的接种量接入培养基中，55℃，160 r/min振荡培养48h后。漆酶在以葡萄糖为碳源的培养基中活性最高，达到110.23U/mL。因此，选用葡萄糖作为最优碳源进行后续优化。
2.2 氮源对发酵液中漆酶活性的影响
在以葡萄糖为碳源后，设置不同氮源，将种子液按1%的接种量接入培养基中，55℃，160r/min振荡培养48h后。漆酶在以牛肉膏为碳源的培养基中活性最高，达到105.67U/mL。因此，选用牛肉膏作为最优氮源进行后续优化。
2.3 初始pH对发酵液中漆酶活性的影响
在碳源、氮源后，设置不同的初始pH，将种子液按1%的接种量接入培养基中，55℃，160r/min振荡培养48h后。漆酶在以pH为6的培养基中活性最高，达到120.13U/mL。因此，选用初始pH为6进行后续优化。
2.4 培养温度对发酵液中漆酶活性的影响
由图1可知，在碳源、氮源和初始pH后，设置不同的培养温度，将种子液按1%的接种量接入培养基中，160r/min振荡培养48h后。漆酶在以培养温度为45℃的條件下活性最高，达到117.23U/mL。因此，选用培养温度为45℃进行后续优化。
2.5 培养时间对发酵液中漆酶活性的影响
由图2可知，在碳源、氮源、初始pH和培养温度后，设置不同的培养时间，将种子液按1%的接种量接入培养基中，160r/min振荡培养。漆酶在以培养时间为48h时活性最高，达到121.24U/mL。
3 结论
通过对高温木质素分解菌在碳源、氮源、培养基初始pH、发酵时间和发酵温度等5个单因素方面进行优化，获得高温木质素分解菌产漆酶的最优培养条件。最终确定最优的碳源葡萄糖、氮源为牛肉膏、pH为6、培养温度为45℃、发酵时间为48h。经过单因素条件的优化来制备发酵液和菌剂，为后续农作物秸秆和园林有机废物的降解提供了帮助。
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