摘要：【目的】克隆松墨天牛（Monochamus alteratus）葡萄糖-6-磷酸異构酶（GPI）基因cDNA序列，探究其分子特征，为深入研究松墨天牛GPI的分子功能打下基础。【方法】采用RACE技术克隆松墨天牛GPI基因cDNA序列，并对该序列及其编码氨基酸序列进行生物信息学分析。【结果】克隆并鉴定松墨天牛GPI基因，命名为MaGPI（GenBank登录号：KU323592），该基因序列长1038 bp，共编码279个氨基酸。同源比对分析发现，松墨天牛与赤拟谷盗（Tribolium castaneum）的同源性最高，达90%，而与其他昆虫的同源性在76%以上。系统发育进化树分析结果表明，松墨天牛与赤拟谷盗在同一分支，与家蚕（Bombyx mori）相隔最远。MaGPI为亲水蛋白，含有5个功能位点：活性位点、变构位点、活性部位盖子和两个多肽结合位点。【结论】明确了MaGPI的核苷酸序列及编码蛋白特征，为进一步研究MaGPI的分子功能提供依据。
关键词： 松墨天牛；葡萄糖-6-磷酸异构酶；克隆；生物信息学
中图分类号： Q966 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）05-0657-05
Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to clone full-length cDNA of glucose-6-phosphate isomerase（GPI） from Monochamus alteratus， and analyze its molecular characteristics， in order to lay the foundation for further studying its functions. 【Method】The cDNA of GPI gene was cloned from M. alteratus using RACE technology. The gene sequcence and its amino acid sequence were analysed using bioinformatics softwares. 【Result】The GPI gene was cloned successfully from M. alteratus， and named MaGPI（GenBank accession no. KU323592）. Its cDNA was 1038 bp in length， encoding 279 amino acids. The alignment of amino acid sequences showed that， MaGPI shared the highest homology（90%） with GPI gene of Tribolium castaneum， and shared homology of 76% with other insects. The phylogenetic tree showed that M. alteratus and T. castaneum was in the same branch， and far from Bombyx mori. MaGPI was a hydrophilic protein， with 5 functional sites viz.， active site， allosteric site， cap of active site， peptide binding site. 【Conclusion】The sequence of nucleotide and characteristics of amino acid sequence encoded by MaGPI gene have been clarified， in order to provide a foundation for further researching molecular function of MaGPI.
Key words： Monochamus alteratus； glucose-6-phosphate isomerase； clone； bioinformatics
0 引言
【研究意义】松墨天牛（Monochamus alteratus）是毁灭性松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）病的主要媒介昆虫和森林蛀干害虫（Togashi，1989），寄主多为松属（Pinus）植物（杨建霞等，2009），主要危害衰弱、濒死及新伐的树木。自松墨天牛传入我国以来，目前在江苏、浙江、福建、安徽、台湾和香港等地区均有分布（张锴等，2010），国外分布于日本、朝鲜、老挝等国（杨宝君等，2003）。我国自1982年发现松材线虫病后（杨宝君等，2003）便一直致力于该病的防治，其防治除杀死宿主松墨天牛外并无其他更好的办法，但松墨天牛有优良的防护机制，外壳（几丁质）即是其中之一。葡萄糖-6-磷酸异构酶（Glucose-6-phosphate isomerase， GPI）是参与糖代谢的糖酵解作用的一种酶，主要通过转移碳位上的质子催化葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate， G-6-P）与果糖-6-磷酸（Fructose-6- phosphate， F-6-P）的相互转换（Rose，1975）。GPI是一种非常保守的酶（Grauvogel et al.，2007），不仅参与糖代谢，还可在动物细胞中调节细胞分裂和生长因子活性（Funasaka and Raz，2007；Chiu et al.，2008），在昆虫中参与几丁质的合成（Candy and Kilby，1962）。因此，研究葡萄糖-6-磷酸异构酶可对松墨天牛的防治起到借鉴作用。【前人研究进展】自Noltmann（1964）首次从兔肌肉中分离GPI以来，关于GPI的研究报道逐渐增加，研究对象广泛，主要有人类（郑静等，2012）、鱼类（Cao et al.，2000）、植物及微生物等（Cui et al.，2010），较多涉及人类类风湿关节炎的研究；研究内容包括GPI的空间结构和生物活性等。但GPI在昆虫领域的研究很少，仅见在桔小实蝇中有GPI基因克隆的报道，并通过饥饿饲喂和几丁质含量测定等方法进行初步研究（陈力，2013）。【本研究切入点】GPI在昆虫几丁质合成过程中起重要作用，但目前未见有关松墨天牛GPI的研究报道。【拟解决的关键问题】应用RACE技术克隆松墨天牛GPI基因cDNA全长，应用生物信息学技术分析其编码蛋白理化性质；构建氨基酸序列比对图谱及系统发育进化树；模拟松墨天牛GPI三级结构，预测功能结构域，旨在为深入研究松墨天牛GPI的分子功能打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试松墨天牛成虫采自广州市从化区马尾松次生林，将其置于液氮中冰冻，于-70 ℃保存备用。
主要试剂：E.Z.N.ATM Total RNA Kit II总RNA提取试剂盒购自OMEGA公司；3"-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase试剂盒、pMD20-T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞等试剂购自宝生物工程（大连）有限公司；通用型DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。
1. 2 总RNA提取及cDNA第一链
参照总RNA提取试剂盒说明，取预先备好的松墨天牛成虫20 mg，液氮研磨后提取松墨天牛总RNA，并用微量紫外分光光度仪（Nanodrop 2000）检测其浓度和1.5%琼脂糖电泳检测其完整性。参照3"-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase试剂盒说明进行操作，反转录产物于-20 ℃保存备用。
1. 3 引物设计及3"RACE扩增
根据已克隆的含有5"端松墨天牛GPI基因cDNA片段序列，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物进行3"RACE扩增，上游引物（用于Outer PCR）：5"-
ACAAGCCCTTACTGTCGGTG-3"和下游引物（用于Inner PCR）： 5"-GTGGACCGTGTCTGCTTTC-3"。Outer PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行20个循环；72 ℃延伸10 min；-20 ℃保存。Inner PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环；72 ℃延伸10 min；-20 ℃保存。反应结束后，取5 μL PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。目的条带纯化回收后与pMD20-T载体重组过夜，再转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37 ℃培养过夜，经蓝白斑筛选并进行菌落PCR鉴定后，挑选阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1. 4 DNA序列及其编码的氨基酸序列分析
使用DNASTAR软件对松墨天牛GPI基因进行全长拼接；利用在线工具NCBI（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对拼接后的DNA序列进行BLAST比对；用DNAMAN软件进行同源性分析；采用ClustalX和MEGA 5.0软件进行系统发育进化树构建（NJ法）；采用ProtPram软件进行理化性质分析；采用ProtScale分析疏水性；采用SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）预测信号肽；采用SMART在线工具（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_ gor4.pl）预测二级结构；采用NCBI Conserved Domains在线网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi）分析氨基酸序列的结构功能域；采用3D-JIGSAW Protein Comparative Modelling Server在线工具（ttp：//bmm.crick.ac.uk/～3djigsaw/）对MaGPI进行三级结构模拟，再用Rasmol软件对其进行视化处理。
2 结果与分析
2. 1 基因克隆
通过TA-克隆法测序得到目的片段3"端，与已克隆得到的含有5"端cDNA片段序列拼接后得到1038 bp的松墨天牛GPI基因全长序列，命名为MaGPI（GenBank登录号：KU323592）。MaGPI包含840 bp开放阅读框（ORF）和3"端非编码区198 bp，编码279个氨基酸。采用ProtPram软件分析氨基酸序列的理化性质，结果显示，该蛋白分子质量为31.75 kD，等电点为6.27，分子式为C1441H2215N375O415S10，为稳定蛋白。采用ProtScale在线工具分析MaGPI的疏水性，结果表明该蛋白为亲水蛋白，最小值为-2.578，最大值为1.789。SignalP在线工具预测MaGPI没有信号肽；NetPhos 2.0网站预测MaGPI有6个丝氨酸（Ser）磷酸化位点，4个苏氨酸（Thr）磷酸化位点，3个酪氨酸（Tyr）磷酸化位点；DictyOGlyc在线工具预测表明该蛋白没有糖基化位点。
2. 2 同源比对分析
通过MaGPI的840 bp完整开放阅读框推导出由279个氨基酸残基的多肽序列，在NCBI上进行BLASTP同源搜索，获得约50个昆虫的GPI的氨基酸序列。经同源性比对，MaGPI序列与赤拟谷盗（Tribolium castaneum）的同源性最高，高达90%，与家蚕（Bombyx mori）的同源性最低，为76%，与其余物种的同源性在80%以上（图1）。
2. 3 系統发育进化树分析
基于MaGPI及8种昆虫（鞘翅目、膜翅目、双翅目、半翅目、鳞翅目）的GPI，采用NJ法构建系统发育进化树。结果表明，松墨天牛与赤拟谷盗的同源性最高，在同一分支上；与家蚕的同源性最低（图2）。
2. 4 蛋白结构分析
采用SMART软件分析MaGPI的二级结构，结果显示该蛋白序列41.94%为α螺旋，20.43%为β片层， 37.63%为随机卷曲。采用COILS软件分析卷曲螺旋结构发现，MaGPI在97～136位点处可形成螺旋卷曲。通过TMHMM软件分析跨膜结构，结果显示MaGPI整条肽链均在膜外，并不存在跨膜结构域，因此该卷曲螺旋可能为MaGPI的功能结构域。
通过3D-JIGSAW Protein Comparative Modelling Server软件对MaGPI进行三级结构模拟，再经Rasmol软件处理，发现该蛋白有8个明显螺旋结构（图3），在中间含有一个明显的空位（如红色箭头处）。
2. 5 功能结构域分析
NCBI Conserved Domains软件分析发现，MaGPI隶属于糖磷酸异构酶家族，为葡萄糖-6-磷酸异构酶。该蛋白具有5个保守结构域（图4）：（1）活性位点为41～208；（2）变构位点S151SLVSRTRVKT161；（3）活性部位盖子A163QDTLEANARFFGNDISKVP182；（4）多肽结合位点为150～232；（5）多肽结合位点为168～247。
3 讨论
本研究采用RACE技术克隆了松墨天牛GPI的cDNA全长，该基因序列全长1038 bp，包含840 bp的开放阅读框和10个poly（A）尾巴结构，可编码279个氨基酸，同源性比对和系统发育进化树分析结果表明MaGPI与其他昆虫同源性在76%以上，与赤拟谷盗的同源性最高，达90%。可见，MaGPI与其他昆虫的GPI，特别是与鞘翅目昆虫在序列结构上具有较高的保守性。
为研究MaGPI的结构与功能的关系，本研究采用3D-JIGSAW软件对其进行结构模拟和NCBI Conserved Domains软件分析其功能结构域，结果表明，MaGPI三级结构多为α螺旋，功能位点包括活性位点、变构位点、活性部位盖子和两个多肽结合位点。通过分析其他昆虫序列，发现昆虫在这些位点上也相当保守，这些信息为下一步研究其表达模式和功能打下了基础。但是，这些功能位点的具体机制尚不明确，需要进一步探究。
GPI是一种二聚酶，能催化葡萄糖-6-磷酸与磷酸-
6-果糖间的转换。该酶也能影响机体内细胞分裂和生长因子活性，近年来多作为一种自身免疫性抗原进行研究，尤其是与人类的类风湿关节炎疾病有关（Zhu and Feng，2013）。GPI是必需的看家酶，由单一的基因位点编码，因此干扰该基因会导致有机体死亡。有研究表明，若老鼠缺失GPI基因将会导致胚胎死亡（Kugler and Lakomek，2000），但在昆虫中未见有关GPI基因干扰的报道，仅明确GPI是昆虫的几丁质合成通路的八大酶之一（Candy and Kilby，1962），在几丁质合成过程中不可或缺，而其合成机制有待深入探讨。本研究结果丰富了松墨天牛几丁质合成通路基因的遗传信息，为深入探讨几丁质合成机制提供了分子依据。
几丁质合成过程中除了不能缺少GPI外，还不能缺少其他7种酶，分别为：己糖激酶（Hexokinase）、海藻糖酶（Trehalase）、葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶（Glucosamiine-6-phosphate-N-acetyltransferase）、谷氨酰胺：6-磷酸果糖转移酶（Glucosamine-6-phosphate aminotransferase）、磷乙酰氨基葡萄糖變位酶（Phosphoacetylglucosamine mutase）、几丁质合成酶（Chitin synthase）和UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶（UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase）（Kugler and Lakomek， 2000），若缺少其中的某种酶，将会导致几丁质合成通路受阻，使昆虫因缺少几丁质而不能存活。近年来，通过干扰和破坏几丁质的生物合成防治昆虫的研究逐渐增多，主要集中在几丁质合成抑制剂的使用方面，研究发现几丁质合成抑制剂的防治效果明显优于传统的化学试剂（刘炳荣和钟俊鸿，2006；赵忠伟等，2011）。通过研究MaGPI的结构信息，可为研究其在几丁质合成通路中的具体机制，进而为研发优良的生物杀虫剂打下了基础。
4 结论
克隆获得松墨天牛GPI基因cDNA全序列，包括840 bp开放阅读框，共编码279个氨基酸，采用信息学软件分析，发现MaGPI为亲水蛋白，与赤拟谷盗（T.castaneum）同源性达90%，含有5个功能位点：活性位点、变构位点、活性部位盖子和两个多肽结合位点。
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（責任编辑 温国泉）
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