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[摘要] 目的 探讨氟伐他汀对同型半胱氨酸（Hcy）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）信使核糖核酸（mRNA）表达的影响。 方法 分离培养HUVECs，分为正常对照组、Hcy刺激组：100 μmol/L Hcy与细胞孵育24 h，3种不同浓度的氟伐他汀干预组：分别以不同浓度的氟伐他汀（0.1、1、10 μmol/L）预孵育细胞24 h，再与100 μmol/L Hcy共同培养24 h，应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测LOX-1 mRNA的表达。 结果 Hcy显著诱导HUVECs LOX-1 mRNA的表达，氟伐他汀抑制Hcy诱导的LOX-1 mRNA的表达，并呈现一定剂量依赖性。 结论 Hcy可能通过LOX-1介导其内皮损伤作用，氟伐他汀可能通过减少LOX-1过度表达发挥其抗动脉粥样硬化作用。
[关键词] 氟伐他汀；凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1；同型半胱氨酸；内皮细胞；动脉粥样硬化
[中图分类号] R972 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）06（c）-0169-04
[Abstract] Objective To investigate the effect of fluvastatin on the expression of LOX-1 induced by homocysteine （Hcy） in cultured human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）. Methods Human umbilical vein endothelial cells were cultured and treated with Hcy （100 μmol/L for 24 hours） alone， or pre-treated with fluvastatin （0.1， 1 or 10 μmol/L for 24 h）， followed by Hcy treatment. After respective treatment， the expression of lectin-like ox-LDL receptor-1 （LOX-1） was measured by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results Hcy （100 umol/L） treatment up regulated the expression of LOX-1 in HUVECs. Pretreatment of HUVECs with fluvastatin （0.1， 1 or 10 μmol/L） decrease Hcy-induced expression of LOX-1. A high concentration of fluvastatin （10 umol/L） was more potent than the lower concentration （1 μmol/L）. Conclusion These observations indicate that endothelial dysfunction elicited by Hcymay beassociated with an increase of LOX-1 expression. Inhibition of expression of LOX-1 may be another mechanism of beneficial effects of statins in vascular diseases.
[Key words] Fluvastatin； Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1； Homocysteine； Endothelial cells； Atherosclerosis
动脉粥样硬化是心脑血管疾病的病理基础，内皮功能障碍则是动脉粥样硬化的始动环节。研究证实同型半胱氨酸（Hcy）能够导致内皮损伤，促进动脉粥样硬化形成[1]。已知他汀类药物具有抗动脉粥样硬化作用，其中独立于降脂作用以外的内皮保护功能尤为重要。LOX-1作为氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）的内皮细胞受体，通过介导oxLDL在内皮细胞的多种生物学效应，参与动脉粥样硬化的形成[2]。多种炎症因子、氧化应激因素都可诱导LOX-1的表达。但目前鲜有关于Hcy对内皮细胞LOX-1表达诱导以及氟伐他汀对内皮细胞LOX-1表达影响的研究。故本研究拟探讨氟伐他汀在体外对Hcy诱导的LOX-1表达所具有的影响。
1 材料与方法
1.1 一般材料
DL-同型半胱氨酸（Sigma公司），氟伐他汀原药粉（Novartis公司，批号：X0362），RPMI1640培养基、胎牛血清、人AB血清（GibcoBrl公司），青霉素、链霉素、胶原酶Ⅰ型（Sigma公司），0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA（HyClone公司），HEPES、PBS缓冲液、内皮生长因子（Sigma公司），肝素钠（Solarbio公司），内皮细胞鉴定试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），逆转录试剂盒（Promega公司），通用PCR优化试剂盒Ⅰ（博大泰克公司）。
1.2 人脐静脉内皮细胞分离培养与鉴定
无菌条件下取健康产妇脐带，PBS缓冲液反复冲洗后，加0.1%胶原酶，37℃消化15 min，离心后加完全培养基RPMI1640（10%胎牛血清，10%人AB血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，50 ng/mL内皮生长因子，50 μg/mL肝素钠储存液），置37℃、5%CO2孵箱中培养，24 h后换液，待人脐静脉内皮细胞80%融合，用胰蛋白酶-EDTA消化传代，经Ⅷ因子鉴定后，第2～3代用于实验。
1.3 实验分组
实验分为五组：①正常对照组：HUVECs与培养基孵育24 h； ②Hcy刺激组：100 μmol/L Hcy与HUVECs孵育24 h；③低浓度氟伐他汀干预组：以0.1 μmol/L氟伐他汀预处理HUVECs后，再与Hcy共同培养24 h；④中浓度氟伐他汀干预组：以1 μmol/L氟伐他汀预处理HUVECs后，再与Hcy共同培养24 h；⑤高浓度氟伐他汀干预组：以10 μmol/L氟伐他汀预处理HUVECs后，再与Hcy共同培养24 h。每组4个样本。
1.4 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测LOX-1mRNA的表达
培养结束后按常规方法提取细胞总RNA，并进行纯化，反转录为cDNA。用于LOX-1基因序列扩增的引物序列：上游5"-AAGGACCAGCCTCATGAGAAG-3"，下游5"-TTGGCATCCAAAGACAAGCAC-3"。以β-actin为内参照物，引物序列：上游5"-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3"，下游5"-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3"。PCR反应程序为：94℃变性3.5 min→94℃ 40 s→54℃ 退火1 min→72℃ 延伸1 min，重复40个循环。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，紫光灯下拍照，将凝胶电泳图像输入GeneGenius凝胶分析系统，应用GeneTool计算同一管内LOX-1与β-actin扩增条带吸光度比值作为其相对表达强度。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0进行统计分析。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
正常对照组有极微量LOX-1 mRNA 的表达（0.08±0.01）。与正常对照组比较，100 μmol/L Hcy与HUVECs孵育24 h显著诱导LOX-1mRNA的表达（0.40±0.09），Hcy刺激组LOX-1mRNA水平（0.36±0.04）升高至正常对照组的5倍（P < 0.05）。氟伐他汀干预组可减轻LOX-1 mRNA在HUVECs的过度表达。但与Hcy刺激组相比较，0.1 μmol/L氟伐他汀组仅轻度减轻LOX-1 mRNA水平。而1 μmol/L氟伐他汀组（0.27±0.03）与10 μmol/L氟伐他汀组（0.13±0.02）均可显著降低LOX-1 mRNA水平（P < 0.05），且10 μmol/L氟伐他汀组较1 μmol/L氟伐他汀组的抑制作用比较，差异有统计学意义（P < 0.05），呈现出一定剂量依赖性。见图1。
3 讨论
LOX-1是1997 年由Sawamura等[3]在牛主动脉内皮细胞上发现的oxLDL的一种新型受体，主要在血管内皮细胞表达，也存在于平滑肌细胞、巨噬细胞、血小板和心肌细胞。其基础表达水平较低，但可以被多种致动脉粥样硬化的因素所诱导增强，包括oxLDL自身、氧化应激、机械刺激的切应力、肿瘤坏死因子-α、肿瘤生长因子-β1、C反应蛋白、内皮素-1、血管紧张素Ⅱ、血管紧张素Ⅱ受体、高糖[2]。LOX-1介导oxLDL在内皮细胞的多种生物学效应，导致内皮细胞损伤，在动脉粥样硬化的形成中至关重要。
Hcy是近年来确认的一种新的独立的促动脉粥样硬化的危险因子。它通过内皮损伤、氧化应激、炎性反应等多方面参与动脉粥样硬化进程。其中内皮功能障碍是Hcy导致动脉粥样硬化的重要原因。目前已知Hcy能够破坏内皮屏障、诱导内皮细胞调亡、增加内皮表面单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）等的表达、抑制内皮衍生舒张因子的合成释放和活性等，造成内皮的损伤[4-6]。近期有研究发现在Hcy刺激下，内皮细胞的oxLDL浓度明显升高，同时LOX-1 mRNA的表达显著增加[7]。本研究应用人脐静脉内皮细胞与Hcy共同孵育，结果显示，LOX-1的基础表达水平较低，而Hcy能够显著上调LOX-1 mRNA的表达，这与此前的研究结果相一致[7-8]，上述结果提示Hcy可能通过LOX-1导致内皮损伤，参与动脉粥样硬化的形成。
有研究表明Hcy可促进低密度脂蛋白氧化修饰成oxLDL[9]，而oxLDL即可上调LOX-1的表达，本研究中Hcy上调LOX-1表达的机制可能就经由oxLDL途径进行。氧化应激是Hcy造成内皮损伤的主要机制之一。Hcy易于自身氧化，生成超氧阴离子，产生活性氧（ROS），降低一氧化氮（NO）生物活性。Hcy还通过降低抗氧化酶的生物活性间接导致氧化应激的产生[10]。据此推测Hcy很可能通过产生的ROS以及所形成的氧化应激上调LOX-1的表达。Miki等[11]的研究中在加入Hcy前，事先用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸处理胎牛主动脉内皮细胞，结果部分抑制了Hcy诱导的LOX-1表达，亦提示Hcy可通过氧化应激上调LOX-1的表达。
他汀类药物广泛应用于高脂血症的治疗。有关冠心病患者的临床试验证实他汀类药物能够降低主要心血管事件的风险，延缓动脉粥样硬化的进展[12-13]。他汀类药物对心血管病发病率和病死率的降低得益于他汀类的多效性。他汀类除了直接抑制胆固醇合成外，还具有独立于降脂作用以外的多效性，包括改善内皮功能、抑制平滑肌细胞增殖、减少血管炎性反应和抗血小板作用等。oxLDL经内皮细胞摄取后，内皮细胞激活，内皮细胞分泌功能及完整性改变，继而白细胞、单核细胞及血小板沉积在血管内膜，完成了动脉粥样硬化的早期进程，在此过程中LOX-1激活至关重要[14-16]。目前已有一些关于他汀类药物在体外抑制LOX-1表达的研究。辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀预处理人冠状动脉内皮细胞可以下调ox-LDL诱导的LOX-1表达[17-20]。辛伐他汀还可以在鼠血管平滑肌细胞下调ox-LDL诱导的LOX-1表达[21]。洛伐他汀可以下调人脐静脉内皮细胞及血管平滑肌细胞的LOX-1表达[22]。氟伐他汀能够下调血管平滑肌细胞的LOX-1表达[23]。但有关氟伐他汀在内皮细胞对LOX-1表达的研究鲜有报道。本研究应用氟伐他汀预处理人脐静脉内皮细胞，以Hcy作为刺激因子，结果发现氟伐他汀能够抑制Hcy诱导的LOX-1表达，提示氟伐他汀可能通过下调LOX-1过度表达发挥内皮保护作用，改善Hcy对内皮的损伤。在本研究中高浓度（10 μmol/L）氟伐他汀比低浓度（1 μmol/L）氟伐他汀对Hcy诱导的LOX-1mRNA表达的抑制作用更强，具有浓度依赖性。在此前的研究中，辛伐他汀及阿托伐他汀亦呈现出类似的浓度依赖性[17-19]。
目前对于他汀类药物下调LOX-1表达的作用机制还未明确。有研究发现他汀类药物可增加内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的稳定性、增加内皮细胞NO的产生，其中氟伐他汀能增加培养的人血管内皮细胞的eNOS浓度[24]。离体实验发现氟伐他汀不仅能保护ox-LDL不被氧化，还可有效清除自由基活性[25]。均证实氟伐他汀的抗动脉粥样硬化作用并不限于它的降脂作用，是与它的抗氧化效应亦相关。而内皮细胞LOX-1的表达受到氧化应激状态的诱导，因此认为Hcy氧化产生ROS，形成的氧化应激上调了LOX-1在内皮细胞的表达，而氟伐他汀可能通过其抗氧化作用抑制Hcy对LOX-1表达的上调作用。
本研究也有一些缺陷和不足，对LOX-1表达的检测采用半定量的RT-PCR方法，未采用更为精准的实时定量PCR或结合蛋白质印迹同时分析检测LOX-1的蛋白表达。没能进一步证实氧化应激是氟伐他汀与Hcy对LOX-1表达调控的作用机制，因此尚需更多的研究去探究他汀类药物对LOX-1表达调控的具体作用机制。
综上所述，本研究揭示了Hcy致动脉粥样硬化的可能机制，Hcy可能通过上调内皮细胞的LOX-1表达形成内皮损害而导致动脉粥样硬化。同时发现氟伐他汀可能通过调控LOX-1表达发挥其抗动脉粥样硬化作用，氟伐他汀能够下调Hcy诱导的LOX-1过度表达，提示对抗Hcy、抑制LOX-1表达可能为他汀类药物降脂作用以外的多效性。
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（收稿日期：2016-02-23 本文编辑：赵鲁枫）
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