中药材分子鉴别现场运用的策略与实践

计划项目”

[通信作者] *黄璐琦，E-mail：huangluqi@263.net 中药材基原真伪鉴别是中药学研究领域中的重要研究方向和首要问题，中药材是否“正本清源”直接影响到用药安全。由于中药材基原具有多样性、复杂性的特点，易受到物种延续性、变异性、地域性和复杂性等因素的影响。因此，对中药材基原鉴别可以从源头上控制中药的质量，对保障中药生产和中药产业的健康发展起到举足轻重的作用^[1]。利用分子生物学技术依据遗传物质DNA在不同生物个体的差异鉴别生物物种，可为中药材品种鉴别提供依据^[2]。近20年间，以PCR技术为基础的中药分子鉴别技术因其不受外界环境的影响、具有较好的客观性，逐渐被业内认可。其中乌梢蛇、蕲蛇分子鉴别方法被《中国药典》（2010年版）收载。笔者认为，对中药鉴定技术的需求不仅仅局限于实验室应用，未来将更主要应用于广泛的实际生产与贸易交流环节。随着分子鉴别技术的发展，构建中药材分子鉴别现场运用模块系统有望实现在产地、药市、药房等进行药材现场分子鉴别，将对中药鉴定学科和中药产业的可持续发展将起到推动作用。

1 中药材分子鉴别现场运用的意义和需求

1.1 分子鉴别现场运用是常规检测手段的延伸

对中药材真伪品的检测通常采用眼看、手摸、嘴尝、鼻闻等方法，正确辨别药材真伪品需要较高的专业技能和长时间经验积累。目前能够熟练掌握这一技能的人才缺乏，且面对种类繁多的中药材，鉴定人员存在主观判断力差异，也影响鉴定的结果。分子鉴别现场运用可以在短时间内实现对药材真伪品的检测，且不受药材外观形态、个体大小和完整性的影响，有利于提高中药材质量监管的科学性和管理效力。

1.2 高通量检测是分子鉴别现场运用的重要优势

在药材抽检的过程中，按照中药材或中药饮片抽验工作程序，样品数量巨大。发展高通量检测技术是缩短检测时间、减少工作量、节约检测成本的重要途径。

1.3 仪器设备简单、成本低廉将有利于分子鉴别现场运用的推广

近年来，许多学者利用分子生物学技术对中药鉴定方法进行了广泛的研究，并取得了丰富的成果。如杨俊宝等^[3]筛选获得2个RAPD引物，可以用于鉴别半夏和掌叶半夏。蒋超等^[4]利用EST-SSR技术对金银花、山银花进行了鉴别方法的研究。DNA条形码技术也被认为是中药鉴别的重要方法之一^[5]。荆志伟等^[6]用基因芯片技术对中药石斛的不同种属进行了鉴别研究，将16个不同种属石斛的ITS序列固定在玻片上制作了基因芯片，用于其中5种石斛的鉴定。然而这些方法目前仅止于实验室阶段，由于其操作繁琐、检测需要大型仪器、耗时长、成本高，难以实现在产地、药市、药房等进行现场鉴别，极大的限制了分子鉴别技术的使用范围和推广程度。

在日常监督工作中对于廉价药材的检测或者对技术较复杂、操作过程繁琐的检测指标进行大批量样品筛检时，往往面临时间和经费的双重困难。利用分子鉴别现场运用系统有望有效解决这一难题。

1.4 在有毒中药、珍稀濒危药材、贵重药材鉴别方面具有广阔的发展潜力

分子鉴别现场运用系统，对药材需求量少，仅需0.1 g药材就可以进行鉴别反应。因此，对于一些价格昂贵或珍稀濒危的药材，该系统具有更广阔的发展潜力。

1.5 中药材快速检测工作模式的探讨

将快速检测车及现场快速检测仪器作为主要工作平台，依托快检实验室开展工作。形成涵盖现场快速检测的药材分子快速检测模式。现场采集的样本可以通过快速检测仪器获得结果，如需实验室检测或需进一步确证，则将样品送回快检实验室获得检测结果。

2 中药材分子鉴别现场运用存在的困难及解决方案

2.1 中药材DNA快速提取

CTAB法、SDS法等^[7]是中药材DNA提取的常用方法，在这些方法中常使用65 ℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性，从而使DNA被释放出来，水浴时间一般为30 min至2 h，这很难满足中药材分子鉴别现场运用的需求。本课题组开发了一种基于碱裂解法的中药材DNA快速提取方法，并申请发明专利，在此基础上研制了中药材DNA快速提取试剂盒。试剂盒中主要包括溶液A和B。简要操作过程：将药材粉末加入溶液A后震荡1 min，再加入溶液B震荡1 min，静置后取上清待用。笔者利用这种方法对市售的180余种药材包括果实类、种子类、花类、全草类、皮类、根类药材及炮制品进行了DNA提取，并选择叶绿体psbA-trnH序列通用引物进行PCR反应及琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明85%药材DNA获得了PCR扩增条带，其中花类、果实种子类及动物类药材DNA获得了100%的PCR成功率，但炮制过的药材PCR成功率明显降低。

2.2 药材真伪鉴别DNA标记的开发及其快速检测

获取药材正品及其市场常见混淆品的核酸信息，并利用生物信息学分析软件对相关序列进行分析，筛选药材真伪鉴别DNA标记，收集不同产地、不同批次的药材正品及其混淆品样品，对真伪鉴别DNA标记进行验证。RAPD，RFLP，ISSR，DNA条形码等DNA标记已被用于中药材的真伪鉴别^[8]，但这些鉴别DNA标记检测的方法大多以PCR技术为基础，荧光定量法^[9]、测序法、限制性内切酶酶切法^[10]、质谱法^[11]、基因芯片^[6]等方法也被用于鉴别标记的检测。但这些方法大多操作复杂、价格昂贵、检测时间长，而且需要大型的仪器设备，因此并不适合于现场鉴别。

单核苷酸多态性SNP（single nucleotide polymorphisms）作为新一代的分子标记，具有数量多、覆盖密度大、遗传稳定性强、多态性丰富的优势，且由于SNPs一般只有2个等位基因，在检测时只需要通过一个简单的“+/-”方式即可进行基因分型，使得其检测易于实现自动化^[12]。基于SNP标记，在病原微生物检测、疾病诊断等研究中陆续开发了一些可用于现场快速鉴别的技术，简化了对仪器和实验室条件的要求、缩短了检测时间，具有很好的发展前景。如等温扩增技术，包括Q复制酶反应（QBRA）、链置换扩增技术（SDA）、切口酶恒温扩增技术（NEMA）、转录依赖的扩增技术（TASTMA，3SR，NASBA）、解旋酶扩增技术（HAD）、滚环扩增技术（RCA）、环介导等温扩增技术（LAMP）、单引物等温扩增技术（SPIA）等^[13-14]，为中药材现场鉴别中的鉴别DNA标记快速检测试剂盒开发提供了思路。

3 研究实例

3.1 中药材分子鉴别现场运用的整体方案

从实际出发，基于药材真伪鉴别DNA标记，设计了一套用于中药材分子现场鉴别的模块系统（图1），包括药材DNA快速提取模块、药材鉴别DNA标记检测模块和保障模块。

图1 中药材分子鉴别现场运用模块系统组成

Fig.1 A module system for the scene application of molecular identification in Chinese medicine materials

3.1.1 药材DNA快速提取模块 包括①手持式研磨仪。配置锂电池，适合野外使用。②中药材DNA快速提取试剂盒，包括溶液A和B，常温保存。

3.1.2 药材鉴别DNA标记检测模块 包括①微型金属加热槽。配置锂电池或车载电源，可用于（65±5） ℃ DNA扩增反应。②便携式紫外灯。配置锂电池，适合野外使用，用于荧光检测，配备小型暗箱。③鉴别DNA标记的快速检测试剂盒。

3.1.3 保障模块 包括①微量移液器。②微量离心管。③吸头、吸头盒。④锋利的剪刀。⑤低温保藏盒，用于储存DNA聚合酶，配置冰袋。

现场鉴别模块系统拥有完善和简单的操作流程，操作时间控制在40～60 min，仪器装置简单、成本低，操作人员无需掌握较好的专业知识，经过简单训练即可进行中药材快速鉴别。

3.2 金银花分子鉴别现场运用研究

3.2.1 金银花真伪鉴别DNA标记的开发 通过对GenBank收录的忍冬属植物叶绿体 trn L-trn F序列进行对比分析，获得金银花真伪鉴别SNP位点，并依据该SNP位点设计特异性引物，对84份金银花基原植物及其市售饮片、混淆品进行双向位点特异性PCR扩增，根据真伪品的特异性条带进行金银花药材鉴别，确定了金银花真伪鉴别SNP^[15]。

3.2.2 鉴别DNA标记的快速检测技术 利用已获得的金银花真伪鉴别SNP，开发了一种改良LAMP技术，通过设计特异性引物，于65 ℃在DNA聚合酶的作用下进行扩增反应。反应产物加入适量的SYBR Green染料，在紫外灯下进行检测，正品样本即可检测产生荧光，混淆品样品则不产生荧光。在此基础上开发了金银花鉴别DNA标记快速检测试剂盒。包括溶液C.缓冲液（常温保存）；溶液D1-4.特异性引物（常温保存）；溶液E.DNA聚合酶（低温保存）；溶液F.SYBR Green染料（常温保存）；溶液G.正对照；溶液H.负对照。

3.2.3 金银花分子鉴别现场运用操作规程 ①用剪刀剪碎药材，取少量样品用手持式研磨仪磨成粉末。②取少量粉末放置于2 mL离心管中，使用中药材DNA快速提取试剂盒进行DNA提取。③使用鉴别DNA标记快速检测试剂盒进行药材的真伪检测。依次在0.2 mL离心管中加入溶液C，溶液D，2 μL DNA提取液，溶液E，放置于微型金属加热槽中，在65 ℃条件下进行DNA扩增反应。反应30 min后，冷却至室温。加入溶液F，混匀后在紫外灯下进行检测。实验设置正、负对照。④判定标准：产生荧光即为正品样本，不产生荧光则为混淆品样品。

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Strategy and practice on scene application of molecular identification in

Chinese medicine materials

YUAN Yuan， JIANG Chao， HUANG Lu-qi*

（National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Accurate and fast identification of Chinese medicine materials has been more difficult work during production and trade. However the molecular identification at present was only used in the laboratory， and difficult to scene application in producing area， market and pharmacy that limited its usage greatly. There are two important technologic bottlenecks for scene application： DNA rapid extraction and fast detection of DNA markers. This study developed a module system for the scene application of molecular identification in Chinese medicine materials.

[Key words] scene identification； molecular identification； Chinese medicine materials

doi：10.4268/cjcmm20131601

[责任编辑 吕冬梅]