谷子遗传转化体系研究进展

摘要：谷子（Setariaitalica）是原产于我国的特色杂粮作物，具有抗旱、耐瘠、耐盐碱、营养丰富等特点，但其生物技术研究相对滞后。本文综述了近年来谷子组织培养、再生体系、遗传转化方法的研究进展，着重介绍了利用农杆菌介导转化及再生体系，并对可能影响转化过程及效果的相关因素进行了阐述。

关键词：谷子；组织培养；农杆菌介导；再生；遗传转化体系

中图分类号：S515.03.2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）04-0134-05

谷子（Setariaitalica）被誉为“五谷之首”，在我国有8000年的栽培历史，是我国传统的营养保健食品。据《本草纲目》记载，谷子具有“祛热、除烦、消食宿”的功效[1]，小米粥在民间更有“代参汤”的美誉。谷子营养价值在谷类作物中最高，且相对均衡，富含蛋白质、氨基酸、维生素以及多种微量元素，其营养价值指标均高于FAO/WHO联合推荐的必须氨基酸模式，是一种不可多得的天然保健食材[2，3]。

谷子具有耐旱、耐贫瘠、耐盐碱的生理特性，在贫瘠土壤和干旱地区生长良好、适应性强、产量稳定[4]。而且，谷子是二倍体自花授粉作物，其基因组较小（约470Mb），生长周期短（50～80d），植株较小[5]，具备作为模式作物的特点。但是，谷子作为一种区域性小杂粮作物，主要在亚洲种植，且以我国为主产国，一直以来存在产量较低，经济效益相对较差的问题，因此围绕谷子开展的相关研究，与玉米、水稻等主要农作物相比起步晚，分子生物学研究相对滞后。2012年，我国科学家率先完成了谷子基因组测序工作，为通过基因工程手段进行谷子种质资源改良、提高产量奠定了基础。目前，建立一套高效的谷子遗传转化和再生体系已成为谷子研究的重中之重。结合以往研究基础，本文对近年来谷子组织培养再生体系和遗传转化方法的进展进行了总结，并探讨了农杆菌介导谷子转化中的主要影响因素，为通过分子育种进行谷子品种改良提供一定的依据和借鉴。

收稿日期：2015-01-28

基金项目：山东省自然科学基金项目（ZR2014CQ024）；山东省农业科学院青年基金项目（2014QNM37）

1谷子组织培养及再生

20世纪70年代，日本学者B3en等[6]最早开始谷子的组培研究，他们将处于四分体到单核小孢子期的谷子花药置于含有2，4-D和KT的Blaydes培养基上，成功诱导出4块胚性愈伤组织并获得了再生植株。Rangan[7]将萌发5天种子的中胚轴区切下诱导出结构紧致的愈伤组织，并可再生植株。在我国，许智宏[等]最早用谷子与狗尾草的幼穗作为外植体进行愈伤的诱导，结果显示，对长度在2cm左右的幼穗进行愈伤诱导效果最好，同时也适宜通过不定芽途径形成再生植株。Rao等[9]以不同谷子品种的成熟胚为外植体，证明谷子不同品种间再生能力存在差异、之后许多国内外学者以谷子叶片、茎尖、成熟种子、幼胚等多种材料为外植体进行研究，均获得了再生植株。本课题组在总结前人经验的基础上，以谷子成熟胚为外植体进行遗传转化的探索，主要选用的为目前已经测序的谷子品种“豫谷1号”，也取得了一定的进展。

大量研究表明，谷子的组织培养与品种、外植体类型、培养基的组成（添加物）、生长调节因子等因素密切相关[10～19]。袁进成等[20]选用“冀谷11”等4个谷子品种，研究不同条件下谷子成熟胚的再生能力及其影响因素，结果表明谷子的再生能力受基因型影响较大，“冀谷11”的再生能力最好；LS培养基适合谷子的愈伤组织诱导；MSB5培养基适合谷子的分化；在碳源的选择上麦芽糖比蔗糖更易诱导形成优质的愈伤组织，添加山梨醇可以提高愈伤的分化效率；在激素配组上，2，4-D和ZT组合诱导愈伤较好，而NAA和6-BA的组合愈伤分化率较高[20]。根和侧芽的顶端分生组织诱导愈伤效率都非常低[21，22]，不适合作为外植体进行组织培养的研究。王节之等[23]进一步研究了常用激素在谷子组织培养中的应用效果，认为2，4-D和KT配合使用能够有效诱导愈伤组织；6-BA对谷子分化成苗起主导作用；IAA与NAA对谷子幼苗生根无明显作用。目前，谷子的组织培养多选取不同品种穗分化期的幼穗、成熟胚为外植体材料，结合铵含量较低的培养基进行愈伤诱导分化，但要形成高效的再生体系仍需进一步优化。

2谷子遗传转化方法

谷子遗传转化方法包括基因枪法、农杆菌介导法、PEC介导法、超声波介导法、花粉管通道法、子房注射法等。目前，应用较多且较为成熟的方法是基因枪转化法及农杆菌介导法[5]。

2.1基因枪转化法

基因枪法的主要优点是没有明显宿主限制，可将外源基因直接转入可再生细胞中，可转化多种组织和器官。缺点是转化率较低，导入的外源基因拷贝数较多。

Taylor等[24]最早利用基因枪法进行谷子遗传转化，并在愈伤组织中检测到GUS基因的瞬时表达。O"Kennedy等[25]将将磷酸甘露醇异构酶基因manA转化到珍珠粟中，并对转化条件进行了优化。刁现民等[26]以谷子幼穗作为外植体，将pAHC25和pB1121质粒利用基因枪法分别转化到谷子愈伤中，通过检测质粒中GUS基因的瞬时表达情况，分析了影响谷子愈伤组织转化的因素，建立了JQ-700基因枪转化的最佳方法：即钨粉3μg/mg、CaCl21.5mol/L、亚精胺40mmol/L，基因枪转化室高度7cm，轰击速度400～450m/s，转化愈伤组织用量为1～2g。在此条件下，刁现民等[27]以豫谷1号为材料，获得了能够稳定表达抗除草剂基因Bar的转基因植株。

研究表明，基因枪法转化效率主要受启动子类型和选择标记的影响。Taylor等[10]通过研究谷子悬浮培养细胞和未成熟胚中CaMV35S启动子和玉米Ubiquitin启动子瞬时表达GUS基因的效率，比较了这两种启动子在谷子中表达活性的差异，结果显示，玉米Ubi启动子的活性在悬浮培养细胞中比35S启动子高5倍多，在未成熟胚中高2倍多，表明玉米Ubi启动子相对于35S启动子更适合谷子的遗传转化。这与刁现民等[28]的研究结果相同。新霉素磷酸转移酶（NeomycinPhosphotransferseⅡ，NPTⅡ）基因是转化中常用的选择标记基因，该基因的编码产物可以使卡那霉素失活，因此在培养基中添加卡那霉素可以用于筛选阳性再生植株，但是长期在卡那霉素的压力下会导致愈伤组织胚状体分化效率降低甚至使后代不育。董云洲等[29，30]用基因枪法转化谷子花粉和未成熟幼穗，在进行卡那霉素筛选过程中发现植株分化受到严重影响。潮霉素B和除草剂Basta是水稻遗传转化中常用的筛选剂，Lambé等[31]的研究显示，利用潮酶素B筛选转基因植株，对愈伤分化的影响较小，可获得可育植株。Girgi等[13]利用基因枪法将含有Bar基因和GUS基因的载体转化到4个谷子品系（842B、7042、MangaNara、BongoNara）中，成功筛选到转基因株系5株。

2.2农杆菌介导的遗传转化

2.2.1转化体系根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）能将自身Tumor-inducing（Ti）质粒的一段DNA（T-DNA）转移到植物基因组中，使植物损伤部位形成冠瘿瘤。相对于基因枪法，农杆菌介导的转化系统转化机理清楚、转化外源DNA结构完整、插入基因拷贝数低、遗传稳定性好、再生植株可育性较高、操作简单、费用低，因而成为植物转基因技术的主要方法。

王永芳等[32]率先分析了包括菌液浓度、侵染时间、共培养时间等影响农杆菌侵染的各种因素，初步建立了谷子农杆菌转化体系：侵染使用的农杆菌菌株为LBA4404，浓度为OD600=0.5，侵染液中加入100μmol/L乙酰丁香酮，侵染后利用超声波或真空泵处理可提高转化效率，共培养条件为22℃黑暗2～3天后取出愈伤在含羧苄西林钠和头孢唑林钠各250mg/L的0.1%甘露醇中浸泡30min除菌，接于选择培养基上进行筛选和再生，最后置于1/2MS培养基中生根。按建立的转化程序，对3个谷子品种（豫谷1号、高39、鲁谷10号）进行了转化，获得35棵具有抗性的再生植株。刘颖慧等[33]用谷子幼穗、未成熟种子和成熟种子分别诱导愈伤，将带有GUS基因的双元表达载体PBI121，通过农杆菌LBA4404介导转化愈伤组织，最终只有幼穗的愈伤组织获得了转化植株，其他外植体获得的愈伤侵染后仅检测到瞬时表达。再生植株通过Southern杂交和GUS活性检测，表明外源基因已整合到谷子基因组中，并可有效表达，转化效率为6.6%。

从目前的研究报道来看，应用农杆菌介导法转化谷子虽然取得了成功，但与玉米、小麦等转化体系相比，转化效率仍然过低，因此需要对影响转化的各种因素进行优化，以期获得稳定、高效的转化体系。

2.2.2影响因素①受体基因型及愈伤组织状态。植物的组织培养存在很强的物种依赖性和基因型特异性，拟南芥（Arabidopsisthaliana）、水稻（Oryzasativa）等离体培养再生植株比较容易，而另一些植物如大豆（Glycinemax）、小麦（Triticumaestivum）等再生植株比较困难[34]。在谷子中的研究表明，基因型是影响农杆菌转化效率的—个重要因素，谷子的组织培养具有品种依赖性。从目前的报道看，冀谷11、豫谷1号、豫谷2号、高39、鲁谷10号均是可以优先选择的受体品种[20，27，32，33]。

愈伤组织的状态决定了农杆菌侵染的效果以及是否能获得再生植株。王永芳等[32]对幼穗和成熟胚诱导的愈伤组织进行了研究，发现幼穗形成的愈伤组织颜色一般为淡黄色，结构致密且有一定硬度，其中含有的白色颗粒或者聚集成块的胚性愈伤作为转化材料效果较好；成熟胚诱导的愈伤组织颜色暗淡，表面呈粘液状，农杆菌侵染后褐化程度高，筛选不易观察，后续再生苗率较低，不宜作为转化外植体。但是幼穗的季节性较强，使用起来局限性大，而成熟胚使用比较方便，所以很多研究者还是选用成熟胚作为外植体进行研究，并成功获得转基因植株，但是其转化率较低，转化条件需要进一步探索和优化。

②菌株及载体选择。由于不同农杆菌菌株侵染不同物种的能力有很大差异，因此选择适宜的侵染菌株就显得至关重要。Joyce比较了农杆菌菌株LBA4404、C58C、AGL1、EHA105转化谷子愈伤的效率，结果显示AGL1的转化效率要高于其他3种菌株。国内研究者多选用农杆菌菌株LBA4404进行转化研究，转化效率均较低。因此在进行谷子转化试验中需要探索适宜的农杆菌菌株和谷子愈伤的组合，进而提高转化效率。

载体中启动子、增强子、内含子和polyA都是影响外源基因存植物中转化成功与否及转化效率高低的重要因素。启动子的活性与基因的表达效率密切相关。35S启动子在双子叶植物应用较多且活性强，但其在单子叶作物中表达活性较低而玉米Ubiquitin启动子在单子叶植物中的活性较高。许多研究也证明Ubi启动子在谷子愈伤组织中的表达强度要高于CaMV35S启动子[10，28]。Lambé[17，31]等研究在CaMV35S、Emu和Adh1启动子以及使用不同的终止子（35Socs和nos终止子）下GUS基因的表达情况，结果表明，获得最高表达效率的是含有Emu启动子、nos终止子和Adh1内含子的表达载体。

③培养基及添加物。在组织培养过程中，外植体的营养主要来自于培养基，因此培养基的成分对转化效率影响很大。目前谷子组织培养的报道中多用MS（pH5.7～5.8，5%～6%的蔗糖，0.3%～0.5%的琼脂）做基本培养基，但也有研究发现在LS培养基上诱导的谷子愈伤状态更好，LS培养基相对MS培养基去除了甘氨酸、盐酸吡哆醇和烟酸这几种成分，因此认为LS培养基中的氨基酸和维生素的配比可能更适合谷类作物的愈伤生长[20]。改良的N6培养基也有作为谷子培养基的报道[35]。

还有一些添加物也可起到促进谷子愈伤诱导及组织再生的作用。例如：AgNO3具有抑制乙烯活性的作用，因此常被添加到培养基中，有研究显示在谷子愈伤诱导过程中加入AgNO3可以使愈伤诱导率提高14%～18%[36]，但是对谷子愈伤的分化影响不大[20]。另外，在培养基中添加酸水解酷蛋白、脯氨酸以及色氨酸均可起到促进谷子愈伤组织生长和分化的作用，但是具体的使用浓度还需要进行探索[20，36]。

3展望

谷子是中国几千年的主栽作物和中华民族的哺育作物。近年来，虽然谷子分子遗传学研究取得了一定的进展，但同水稻、玉米和小麦等主要农作物相比差距仍然较大，谷子产量、品种抗病、抗虫、抗逆性等仍需进一步提高。随着谷子基因组测序工作的完成，建立完备、高效的谷子再生体系进而利用优质外源基因提高谷子产量和品质已成为目前谷子分子生物学研究的主要方向。可以预见，利用基因工程方法将培育出抗逆、高产、优质、商业价值高的谷子新品种。