核酸疫苗的免疫机制及其在禽病防治中的应用

摘要：核酸疫苗是当今疫苗研究的最前沿领域，就核酸疫苗的免疫机制以及在家禽疾病防治中的应用进行了综述。

关键词：核酸疫苗；免疫机制；家禽；应用

中图分类号：S852.4+3；S858.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2010)04-0985-04

随着生物工程技术和分子生物学的发展，禽用新型疫苗的研究有了重要的进展，产生了许多新的具有良好应用前景的新型疫苗，其中核酸疫苗就是其中最为热门的研究方向之一。

核酸疫苗，又称基因疫苗。包括DNA疫苗和RNA疫苗，其中DNA疫苗又称为裸体DNA疫苗或裸DNA疫苗，是指将含有编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA)与质粒重组后直接导人动物细胞内。并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。本文主要就核酸疫苗的免疫机制及其在禽病防治上的应用作一综述。

1　核酸疫苗的免疫机制

核酸疫苗的免疫机制主要有以下3点：一是核酸疫苗接种后，被结合在游离核糖体上的mRNA翻译而表达，合成的内源性抗原蛋白其中一部分以有效的比例结合到泛肽上，进一步结合泛肽，呈递到蛋白酶，降解为多肽，通过抗原肽转运结构(TAP)运送到内质网腔，与MHC-I类分子以亲和吸附方式形成聚合体，多肽MHC-I类分子聚合体通过内质网进人高尔基体，最终到达细胞膜的表面，诱发CD8+细胞毒性T细胞应答的产生。二是另一部分蛋白抗原从分泌它们的抗原递呈细胞(APC)的细胞膜上进入MHC-Ⅱ类型途径，进入MHC-Ⅱ类呈递途径的蛋白在溶酶体中水解，产生大约20-25个氨基酸的多肽，这些溶酶体和包含MHC-Ⅱ分子的囊泡融合。MHC-Ⅱ分子结合合适的多肽形成MHC异聚体，成熟的MHC异聚体在细胞膜表面和CIN+T细胞反应，引发体液免疫应答。三是有一部分抗原多肽递呈给B细胞，使B细胞自身活化，产生特异性抗体，诱发体液免疫。另外递呈后的CD~限制性T细胞(Th)活化、增殖可产生多种细胞因子，进一步促进和强化体液免疫和细胞免疫。核酸免疫后，还可以使肌细胞和抗原递呈细胞被感染，从而使CD4+和CD8+细胞亚群活化，产生特异的免疫应答。以前曾认为该过程需要内源抗原的表达，但现在的研究表明，只要有外源抗原的存在，也能有效地引起I类MHC限制的CTL应答。胞内型的蛋白分子在与MHC I类分子结合后，是诱导细胞免疫的最好抗原形式。

2　核酸疫苗在禽病防治中的应用

2.1禽流感(AI)核酸疫苗

最初开展的禽用核酸疫苗的研究就是以流感病毒血凝素(HA)基因为模板进行的，主要用来评估DNA疫苗对鸡的免疫保护。

Robinson等以禽流感病毒H7N7株血凝素(HA)基因的质粒DNA由不同免疫途径接种鸡，免疫鸡可对致死剂量的H7N7株病毒产生50％的保护率。Kodihalli等用巨细胞病毒启动子和鸡B一肌动朊启动子分别构建了H5亚型HA基因表达质粒，用基因枪免疫鸡，对致死性H5病毒攻击可提供完全保护。重要的是，HA-DNA疫苗对HA1氨基酸序列变异率达11％-13％(与原抗原相比)的致死性抗原攻击交叉保护率仍达95％。KodihaUi等随后发现，HA基因的DNA疫苗免疫过的鸡对不同血清亚型禽流感病毒的攻击也能获得保护，但到目前为止，并没有更进一步的报道。2000年，Kodihalli等研究了包含表达H5血凝素基因质粒和表达H7血凝素基因质粒的联合DNA疫苗效果，以及表达H5亚型NP基因的DNA疫苗效果。结果显示，单一剂量联合DNA疫苗免疫鸡可抵抗H5或H7两种亚型的攻击。但是，表达NP基因的DNA疫苗免疫鸡对H5N8(同一亚型)毒株致死性保护率为50％，对H7N7(不同亚型)毒株致死性保护率为42％。这一研究结果表明，表达NP基因的DNA疫苗不能对机体提供有效保护。Luschow等的试验结果表明。采用重组ILTV(传染性喉气管炎病毒)作为禽流感基因疫苗的载体是一种有效可行的方式。姜永萍等将密码子及表达载体优化的H5亚型禽流感DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5以50μg和10μg剂量单次或加强免疫5周龄海兰褐蛋鸡。结果表明。pCAGGoptiHA5以10v,g加强免疫后，可以诱导商品蛋鸡产生较高水平的HI抗体，并可保护免疫蛋鸡不发生高致病性禽流感病毒攻击后的死亡。

目前，我国研制的H5亚型血凝素基因DNA疫苗，具有良好的免疫原性，通过肌肉注射途径即可达到对同源强毒攻击的免疫保护，并能有效阻断免疫保护存活鸡机体的排毒。国内研制的H7亚型血凝素基因DNA疫苗，在极小的剂量下即可成功诱导免疫保护反应，并有效阻断同源低致病力禽流感病毒在机体内的感染和排毒。美国的Webster等最近用核酸疫苗免疫鸡，预防H5、H7禽流感。试验表明，在H5亚型流感病毒之间，DNA疫苗交叉保护性好，免疫后检不出抗体。而攻毒后出现高滴度的抗体，表明活化的T细胞是DNA介导免疫保护的主要机制。

2.2新城疫(ND)核酸疫苗

Sakaguehi等用鸡做模型，试验了编码新城疫病毒F基因的质粒DNA疫苗的免疫，结果证明，免疫9周后体内有抗体的试验鸡都能抵抗致死剂量NDV强毒的攻击。Sakaguchi等将编码新城疫病毒F蛋白的环状和线状质粒DNA100μg分别肌肉注射1周龄鸡。结果显示，只有注射线状质粒DNA的鸡产生特异性抗体并受到保护。合理选用佐剂可以提高基因疫苗的免疫效果。陈吉祥等用天然磷脂脂质体包裹NDV HN基因的真核表达质粒DcHNMD，NA，免疫5周龄雏鸡，1周后免疫鸡体中的特异性HI抗体开始升高。至第六周空白对照组抗体为2，3010g2，裸DNA免疫组为4，0910g2，脂质体DNA免疫组为4，7510g2；用新城疫强毒F48E9攻击后，未免疫组鸡的存活率为27，28％，裸DNA免疫组存活率为81，82％，脂质体DNA免疫组存活率为90％，表明该质粒DNA被脂质体包裹后不仅增加了动物的特异性抗体产生能力，而且也可以增加动物对新城疫强毒的抵抗力。2003年。方维焕等将含新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因的真核表达质粒Dc DNA 3F的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株(zJ111 pc DNA 3F)口服接种小鼠和雏鸡。结果表明，利用该减毒株作为载体传递DNA疫苗具有相对安全性。顾惠明等通过ELISA、淋巴细胞转化试验检测了核酸疫苗在鸡体内的表达，发现表达产物作为抗原物质刺激机体产生了特异性应答反应，引起了机体特异性的体液免疫和细胞免疫，对新城疫强毒攻击的保护率为75％。

2.3鸡传染性法氏囊病(1BD)核酸疫苗

2000年步志高等将IBDV D78株VP2基因

插入真核表达质粒pCI CMV启动子下游多克隆位点构成pCI VP2，用3周龄SPF鸡进行DNA免疫。结果表明，VP2基因DNA免疫可诱导SPF鸡产生中和抗体，并形成对IBDV超强毒株致死攻击的免疫保护，虽不能阻止临床发病及法氏囊病理损伤发生，但有可能减缓法氏囊病理损伤程度。2001年Chang等111’将IBDV标准强毒株(STC)的VP2、VP3和VP4基因插入表达质粒pCR3，1构成pCR3，1-VP234-STC，肌肉注射1日龄鸡，试验鸡分为DI、D2、D3 3组，每组接种次数依次为1、2、3次(每次间隔1周)，在试验鸡3周龄时用IBDV标准毒株(STC)攻毒，观察10 d，发现D2组免疫保护率达50％-100％，D3组达80％-100％，D3组表现出不同程度的法氏囊萎缩。Tsukamoto等使用CMV启动子或者CMV／β-肌动蛋白嵌合体启动子，构建了两种可以大量表达IBDV VP2抗原的重组火鸡疱疹病毒rHVT-cmvVP2和rHVT-pecVP2。rHVT-oecVP2在体外表达VP2抗原量大约是rHVT-emvVP2的4倍，可以诱导机体对致病性IBDV的完全保护，而rHVT-cmvVP2只有58％的保护。rHVT-pecVP2免疫鸡的抗体水平可以持续增长16周。这些结果表明，HVT载体表达VP2抗原的量直接关系到疫苗的效力，并且可以诱导鸡对致病性IBDV的终身保护。于涟等构建12种真核表达质粒，结果表明，编码VP2基因的DNA疫苗仅能诱导很低水平的中和抗体，几乎不能提供免疫保护；以pCI为表达载体的免疫效果优于pcD-NA3，这就提示DNA疫苗的免疫效果与VP2蛋白的构象、表达载体的调控元件和毒株差异等因素有关。Chang等将IBDV VP2基因克隆到真核表达质粒pCR3.1中，再用RT-PCR方法成功扩增，作为IBDV的DNA疫苗。结果表明，包含有VP2基因的DNA质粒免疫鸡后可以有效地介导机体对IBDV的保护性免疫应答。

2.4　鸡马立克氏病(MD)核酸疫苗

我国最早研制鸡马立克氏病DNA疫苗的是李建伟等于1996年进行的，他们扩增MDV主要免疫基因(gB基因)的PUC19质粒并制成DNA疫苗，分别以200μg和500μg总剂量肌注免疫雏鸡。试验初步证明。MD DNA疫苗有明显的免疫保护作用。丁巧玲等通过构建重组真核表达质粒pcDNA3-gB，将重组真核表达质粒分2组进行雏鸡腿部肌肉注射，试验发现2次用重组真核表达质粒免疫组的免疫保护率为75％：而先免疫重组表达质粒。后免疫rFPV组的免疫保护率仅为50％。说明MDV gB基因DNA免疫可以诱导鸡体产生免疫保护，但rFPV不能对其加强免疫。Tischer等将血清I型MDV克隆到BAC20(细菌人工染色体)上免疫鸡，发现DNA疫苗可以对鸡产生保护作用，但其免疫保护力并不比传统的疫苗高。2002年，Okamura等将新城疫融合蛋白F基因置于MDVI异B启动子下，然后插入CV1-988C17株的VSIO基因构建了抗MDV和NDV效果很好的二联重组体。

2.5　鸡传染性支气管炎(旧)核酸疫苗

步志高等将ORF完整的IBV类M41株S2基因cDNA插入真核表达质粒pCl CMV启动子下游多克隆位点。构成重组质粒pCISI，用于l周龄SPF雏鸡的DNA免疫试验。试验结果表明IBVSI基因DNA免疫可诱导SPF鸡产生特异的IBV中和抗体，并可有效形成阻止相同血清型IBV感染后机体排毒的免疫保护。Yu等通过同源重组的方式在FPV的TK基因中插入编码序列，构建了可稳定表达IBV Ch3株的N蛋白C-端片段(119个氨基酸)的rFPV。并证明了表达的这119个氨基酸片段是宿主的保护性抗原，可以产生对不同IBV毒株的交叉保护性免疫。Wang等构建了包含IBV M41株SJ基因cDNA的rFPV(rFPV-S1)，并且评价了它的免疫潜力。最初用Western blot技术检测出rF，PV-S1在体外有效表达S1，后来通过监测用rFPV-S1免疫过的鸡群血清中IBV特异性的IgG和中和抗体表明，Sl在体内也可有效表达。这种重组病毒可以使机体产生抗IBV的保护性免疫，并能抵抗强毒株IBV M41的攻击。

2.6　鸡传染性喉气管炎(lR)核酸疫苗

孟松树等[21]将分别构建的含有鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗株gB、gC和gD基因的重组真核表达质粒及空载体质粒分组注射雏鸡，攻毒后观察免疫保护效果。结果表明，重组质粒诱导了免疫应答，免疫保护率达到79％。该基因疫苗可以作为预防ILT的一个补充。孟松树等又将分别构建的含有ILTV王岗株gB、gC和gD基因的重组真核表达质粒及CPG DNA佐剂分组肌肉注射SPF鸡，检测了免疫后的抗体水平，并观测了攻毒后的免疫保护效果。实验结果显示，CoG DNA佐剂和DNA疫苗联合免疫后的抗体水平比单一使用DNA疫苗的要高，而佐剂组的发病率、死亡率均低于非佐剂组，保护率则高于非佐剂组。

2.7鸡球虫核酸疫苗

现有报道的球虫重组抗原有5401、GX3202、S07、MZ5-7、Etp28等，其中Bhogal等用活的大肠杆菌表达重组蛋白GX3262来免疫鸡，对柔嫩艾美耳球虫(E，tenellal)和变位艾美耳球虫(E，acervulina)感染鸡产生了部分保护作用。吴绍强等将柔嫩艾美耳球虫

(E，ten,ella)BJ株保护性抗原基因TA4与Etbi基因串联后插入到核酸疫苗载体ocDNA3，1中，然后用重组质粒免疫鸡。结果证明，极少量的质粒DNA(50μg)就能产生良好的免疫效果，可刺激T淋巴细胞增殖，产生免疫保护。抗球虫指数(ACI)在160以上。用Etmic-2和ta4两种基因的表达产物经口服、肌注免疫鸡，然后用柔嫩艾美尔球虫攻击免疫鸡，两种重组表达产物均对E，tenellal球虫有一定的免疫保护作用。Lillehoi等发现用编码-E.ac-ervulina(3-1E)的cDNA皮下注射鸡，其表达的蛋白3-1E可刺激鸡产生高滴度的INF-v，如将3-lEcDNA和编码INF-γ及IL-15的cDNA一起免疫鸡，其保护效果更为明显。有试验证明，将细胞因子与球虫基因联合插入到核酸疫苗载体中构建成免疫调节型DNA疫苗，产生的免疫保护效果要明显优于单独构建的DNA疫苗，且细胞因子对DNA疫苗的作用效果与细胞因子的选择和剂量有关。3结语

核酸疫苗以其制备简便、性质稳定、使用方便、易于保存与运输等优点逐渐显示了广阔的应用前景，但尚处于研究探索阶段，还存在一些问题，如免疫反应低以及安全性等，但随着研究的不断深入，这些问题将逐步得到解决，核酸疫苗也将大量应用于实际生产中，为畜牧业的健康发展提供有力保障。DNA疫苗适于多个物种，可通过胚胎免疫，也可通过局部免疫在禽类体内发挥重要的作用，禽类DNA疫苗免疫研究才刚刚起步，随着对DNA疫苗研究的深入，新的疫苗种类将不断被研制出来。DNA疫苗为预防禽病展示了美好的应用前景，将成为预防和控制禽类传染病的主要疫苗之一。