子房注射法转化‘紫宝石’蝴蝶兰的研究

摘 要 采用子房注射法对‘紫宝石’蝴蝶兰进行外源DNA导入研究，结果表明：不同时期注射和不同注射处理方式对‘紫宝石’蝴蝶兰的落果率影响不同，对胚座组织和种子的GUS染色率的影响也不同，在授粉后65 d时，以2% DMSO为缓冲液，注射400 µg/mL浓度质粒，种子的GUS染色率最高达6.14%。选取各注射时期无菌播种后获得的1 000个原球茎，经系列浓度的潮霉素筛选，结果发现授粉后65 d注射时获得的抗性植株最多，为31株，转化率为3.1%。切取转化植株幼叶及幼根进行GUS检测，均为阳性；随机挑选7株幼苗进行PCR检测，均能扩增出GUS基因和HPT基因条带，说明外源基因已经整合到植株的基因组内。此研究为兰科植物育种提供了一种简单高效的途径。

关键词 ‘紫宝石’蝴蝶兰；子房注射法；遗传转化；PCR

中图分类号 S682 文献标识码 A

Abstract The method of ovary injection was reported for Phalaenopsis ‘Purple Gem’ transformation in this study. Results showed that different injection treatments in different development stage of P. Purple Gem had different effect on the percentage of fertile fruit and GUS staining rate of seeds and placentas. The highest GUS staining rate of seeds from the mature fruit by ovary-injection was 6.14%. The highest 3.1% hygromycin-resistance plants were gained after hygromycin （Hyg） screening by a series of concentration in 65 DAP fruit. Seven plants selected randomLy were detected by GUS assay and PCR analysis of GUS and HPT， and all of them were positive. The results showed the integration and expression of foreign gene were integrated into hygromycin-resistance plants. The successful application of ovary injection for P. Purple Gem transformation could provide a simple and efficient method for the Orchidaceae breeding.

Key words Phalaenopsis ‘Purple Gem’； ovary-injection； genetic transformation； PCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.009

蝴蝶蘭（Phalaenopsis）的花期长、花色丰富艳丽、花姿优雅，是世界上产业化程度最高的兰科观赏植物[1]，蝴蝶兰新品种培育主要依靠杂交育种[2-3]。但随着蝴蝶兰产业的迅速发展，对其品种的新、奇、特等观赏性状和抗病、抗逆等农艺性状的要求越来越高，传统的杂交育种等手段受其技术特点的限制，难以进行定向育种，因此，包括转基因技术在内的分子育种越来越受重视[4]。蝴蝶兰的转基因研究可通过基因枪法[5]和农杆菌介导法[6-10]来进行，但由于蝴蝶兰的遗传转化体系难以建立且转化效率不高，因此研究进展缓慢[11-12]。花粉管通道法转基因是一种操作简单的遗传转化方法，已成功地应用于小麦、水稻、玉米、大豆、棉花、烟草、油菜、甜菜、番茄、甜瓜、西瓜等植物中[13-14]，但在兰科植物中仅有本实验室对石斛兰（Dendrobium nobile）和五唇兰（Doritis pulcherrima）的2例报道[15-16]。王佳等[15]在五唇兰的子房注射法转化的初步研究中证实，五唇兰子房在注射外源DNA后，果实的生长会受到一定的影响，外源DNA进入和整合到基因组的最佳时期为双受精时。本研究以蝴蝶兰杂交品种‘紫宝石’（Phalaenopsis ‘Purple Gem’）为材料，在明确其双受精时间的基础上，对其进行子房注射法转基因技术研究，以期为蝴蝶兰的分子育种提供一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

受体材料为‘紫宝石’蝴蝶兰（Phalaenopsis ‘Purple Gem’），种植于中国科学院华南植物园温室大棚。供体为携带GUS基因和HPT基因的质粒pCAMBIA1301。

1.2 方法

1.2.1 生长发育和花粉管生长观察 ‘紫宝石’蝴蝶兰人工自花授粉后，挂牌记录授粉时间。每隔5 d记录果实长度和宽度的变化。

为确定‘紫宝石’蝴蝶兰授粉后的受精时间，从授粉后10 d开始，采集不同发育时期的子房（前50 d每隔5 d及50～70 d每隔2 d），用2%多聚甲醛+2.5%戊二醛+0.1 mol/L磷酸钠固定24 h以上，苯胺兰染色、制片，并于荧光显微镜下观察花粉管通道的生长过程。

1.2.2 不同注射处理方式对果实发育的影响 采用3种不同的缓冲液[Tris-EDTA缓冲液（TE buffer，pH8.0；1/2 MS+5% sucrose+0.05% SilwetLet 77（细胞表面活性剂）；2%二甲基亚砜（DMSO）]对‘紫宝石’蝴蝶兰子房进行注射，采用的质粒浓度为400 µg/mL，注射时间为65 d；以3种不同的质粒浓度（200、300、400 µg/mL）进行注射时，采用的缓冲液为2% DMSO （F），注射时间为65 d。在5种不同的注射时间[50、60、65、70、75 DAP（day after pollination）]注射时，采用的缓冲液为2% DMSO （F），采用的质粒浓度为400 µg/mL。所有处理的注射量均为25 μL。每个注射时间处理36个果，每种缓冲液和质粒浓度处理60个果，统计不同处理方式对落果的影响。

1.2.3 不同注射处理方式对胎座组织和种子GUS染色的影响 对1.2.2中所有处理获得的果荚和对照的种子及胎座组织浸入适量的GUS染液中，于37 ℃暗处保温12 h后，进行无水乙醇脱色1～2 d观察并拍照。统计不同处理方式对胎座组织和种子GUS染色率的影响。

1.2.4 无菌播种 参考王佳[15]对五唇兰无菌播种的方法，采集‘紫宝石’蝴蝶兰授粉后200 d的成熟蒴果，采用相同的方法进行消毒处理后，将1个果荚的种子制成10 mL的无菌水悬浮液播种于本实验室发明的N16固体培养基[花宝1号（Hyponex 1） 1 g/L + 花宝2号（Hyponex 2） 1 g/L + 蛋白冻（peptone） 2 g/L + 活性碳（activated carbon）1.5 g/L + B5培养基的维生素 + 萘乙酸（NAA）0.5 mg/L + 蔗糖（sucrose）20 g/L + 椰子汁（coconut milk） 100 mg/L + 琼脂（agar）6.0 g/L ] [15，17]，放于温度26～28 ℃、光照时间16 h/d和光照强度1 600～2 000 lx的培养室中进行培养。每个果实播5瓶，每瓶2 mL。采用划线法计数统计萌发率，每瓶约播种1 000粒种子。

1.2.5 选择压的确定和抗性植株的筛选 将未注射的对照材料萌发后60 d的原球茎接种到N16固体培养基（含潮霉素0、12.5、25、50、75、100 mg/L）上，每2周更换1次新的培养基，1個月后统计存活的原球茎数量，并确定最高选择压。

经过上述试验后，将注射或未注射外源DNA的果荚的种子经过60 d的萌发形成原球茎，各取1 000粒转接至选择培养基（含潮霉素50 mg/L）培养30 d，每个培养皿50个原球茎，然后将存活的原球茎转接至选择培养基（潮霉素浓度为75 mg/L）上继续培养60 d，再将存活的原球茎在选择培养基（潮霉素浓度为50 mg/L）上培养30 d，最后转至N16培养基（无潮霉素）上培养60 d，经过4轮筛选后计算存活率。

1.2.6 GUS组织化学检测 将注射和对照的材料（包括胎座组织、种子、根和叶等）浸入适量GUS染液中，于37 ℃暗处保温12 h后，用无水乙醇脱色1～2 d后，观察并拍照。

1.2.7 抗性植株的PCR检测 参考王佳[15]对五唇兰的研究结果，对‘紫宝石’蝴蝶兰采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法分别提取抗性和对照植株基因组DNA，以pCAMBIA1301质粒为阳性对照，非转基因植株为阴性对照。根据HPT基因设计的引物分别为：HPTL 5"-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3"；HPTR 5"-GTGCTTGACATTGGGGAGT-3"，根据GUS基因设计的引物分别：GUSL 5"-GTGAATCCGCACCTCTGG-3"；GUSR 5"-ATCGCCGCTTTGGACATA-3"。20 μL反应总体系：其中植物基因组DNA 1μL；PCRMix（2×） 10 μL；引物L 1μL；引物R 1μL；Taq酶0.2 μL，补加水至20 μL。反应条件：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。产物经w=0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，于UVP凝胶成像系统观察照相。

2 结果与分析

2.1 ‘紫宝石’蝴蝶兰生长发育和花粉管生长观察

‘紫宝石’蝴蝶兰在授粉后，子房才开始膨大发育，而未授粉成功的子房在3～5 d内逐渐萎蔫脱落，因此，授粉是子房开始发育的必要条件。在授粉后5～65 d，蝴蝶兰子房持续增粗增长；在授粉65 d后，子房的长度和宽度基本趋于稳定，随后只有少量的增长和变粗。最终子房平均长度为6.14 cm，平均宽度为1.28 cm，未注射果实中种子的平均数量为13 200粒。

通过显微观察，结果发现大部分果实从60 DAP开始出现有胚胚珠，部分胚囊发育趋于成熟；到65 DAP时，大量花粉管萌发生长至胚珠珠孔（图1）。由此可推测，65 DAP左右可能是‘紫宝石’蝴蝶兰的双受精时间。

2.2 不同注射处理方式对‘紫宝石’蝴蝶兰果实发育的影响

未经注射处理的‘紫宝石’蝴蝶兰的果实不会落果。而在同一时期采用不同注射处理方式产生落果的比率有一定的差异。由表1～3可知，相比其他注射时间，授粉后65 d时，注射对子房发育影响较大，落果率达27.8%（表1）。在注射缓冲液类型的实验中，2% DMSO的落果率最高，为23.3%，远高于TE buffer的8.3%（表2）。在注射不同质粒浓度的实验中，400 µg/mL的落果率最高，为18.3%；而注射200 µg/mL的质粒浓度时，落果率为8.3%（表3）。

2.3 不同处理方式对‘紫宝石’蝴蝶兰胎座组织及种子GUS染色率的影响

采集180 DAP的‘紫宝石’蝴蝶兰成熟果荚，剖开后取胎座和种子进行GUS染色，结果发现注射孔同围的胎座组织和种子染色率较高。从表4～6可知，65 DAP为相对最佳的注射导入时间，胎座组织染色率最高可达27.8%，种子染色率为4.5%，且与其他注射时间相比具有显著性差异。相对较佳的缓冲液类型为2% DMSO，胎座组织染色率为28.3%，种子染色率为2.98%。相对较佳的质粒浓度为400 µg/mL，胎座组织染色率为25.0%，种子染色率为3.02%。将这3种最佳处理方式的组合进行重复试验，即在65 DAP 时、以2% DMSO 为缓冲液注射400 µg/mL浓度质粒处理时，种子的GUS染色率最高，可达6.14%。

2.4 ‘紫宝石’蝴蝶兰无菌播种

经子房注射处理后的‘紫宝石’蝴蝶兰果荚，仅对其果皮进行消毒后，采用注射部位的种子培养时，100%的种子被污染，而未经注射处理的对照中的种子基本无污染。在对子房注射处理后的果荚经常规消毒后，再对种子进行消毒后播种，材料污染情况可有一定程度的降低，但仍有20%～30%的种子染菌，而对照的果荚进行同样的消毒处理后，其染菌率同样为0。

用本实验室发明的N16固体培养基培养，对照果荚中的种子萌发率可达75.0%，显著高于经注射处理果实中的种子。而在65 DAP进行子房注射处理果荚的种子，萌发率最低为40.78%，显著低于其它注射时期，推测此时期进行子房注射会最大程度地影响种子的发育（表7）。

2.5 ‘紫宝石’蝴蝶兰选择压的确定

‘紫宝石’蝴蝶兰原球茎接种4周后，在含0、12.5、25、50 mg/L Hyg的培养基上，原球茎能够保持绿色；在含75 mg/L Hyg的培养基上，原球茎接种1周后开始出死亡，在2周后几乎全部死亡，仅有少数原球茎呈浅黄绿色；在含超过100 mg/L Hyg的培养基上，原球茎全部死亡，特别是在筛选通过子房注射法获得的种子萌发的原球茎时，同样全部死亡（表8）。因此，确定75 mg/L Hyg为转基因幼苗筛选的最高选择压。

2.6 ‘紫宝石’蝴蝶兰潮霉素筛选结果及抗性幼苗PCR鉴定

未经子房质粒注射处理的‘紫宝石’蝴蝶兰种子形成的原球茎，在附加50 mg/L潮霉素的培养基上培养30 d后，死亡率为82%，再w在附加75 mg/L潮霉素的培养基上培养30 d后，全部死亡；而经过注射质粒处理的原球茎在附加50 mg/L潮霉素的培养基上培养30 d后，死亡率约为30%；再在75 mg/L潮霉素的培养基上培养30 d后，约有20%的植株存活；再经过75 mg/L和50 mg/L潮霉素2轮处理，结果见表9，其中在65 DAP注射时，得到的抗性原球茎最多，達31株，转化率达3.1%，而在75 DAP注射时，转化率仅为0.7%（表9）。

随后在不含潮霉素的培养基上培养，获得的抗性植株均能成苗。随机选取7个抗性幼苗，提取总DNA进行PCR检测，全部为阳性株，且选取抗性幼苗的幼根幼叶进行GUS染色，所有材料均为GUS阳性，结果见图2。

3 讨论

大多数兰科植物一个果荚中的种子数量繁多，利用花粉管通道法进行遗传转化有较大的优势，因为即使转化效率较低，也能获得较多的转化植株[15]。但由于大多数兰花花朵完成受粉后，还需要1～3个月才能完成受精作用[12]，采用传统的花粉管通道法易造成DNA降解，难以达到转化的目的。采用子房注射法结合花粉管通道技术能有效地解决这个问题[15-16]，即当兰科植物在受精时，直接在子房中注射外源DNA，利用双受精时卵细胞处于最佳感受态时，外源DNA易于进入和整合的特点从而完成转化，此技术已在五唇兰（Doritis pulcherrima）上获得了初步成功[15]。五唇兰现已被归并入蝴蝶兰属[18-19]，本研究采用的材料‘紫宝石’蝴蝶兰（Phalaenopsis ‘Purple Gem’）是由五唇兰为母本、小兰屿蝴蝶兰（P. equestris）为父本杂交选育而来。唐源江等[20]研究五唇兰在广州地区栽培时的双受精时间为受粉后45 d左右。而在本研究中，‘紫宝石’蝴蝶兰的双受精时期为受粉后65 d左右，比五唇兰晚。在‘紫宝石’蝴蝶兰的双受精时期注射，也被证实了成功发育的果实具有较高的种子GUS染色率和遗传转化率，但在本研究中，此时期注射具有较高的落果率，主要原因可能是果实在双受精时期注射外源DNA时更易受到伤害，但从遗传转化效果来看，65 d时进行子房注射仍是最佳的注射时间。另外，在对‘紫宝石’蝴蝶兰胎座组织进行GUS染色检测时，发现未注射果实的胎座组织不能染色，而处理过的果实的胎座组织出现不同比例的染色，推测胎座组织在受精过程或者种子发育的某段时间也处于较高的活性状态，能将外源DNA整合到其中，也可能是种子吸收外源DNA的通道。

植物的杂交种具有杂种优势，本研究中采用的‘紫宝石’蝴蝶兰的种子萌发率比五唇兰高。本实验室中对照种子在N16号固体培养基上萌发率可达75.0%，通过子房注射处理的种子萌发率为52.5%，而五唇兰的种子萌发率分别为66.11%、21.85%。特别是在进行潮霉素筛选时，五唇兰适合的潮霉素浓度为30 mg/L→40 mg/L→50 mg/L→无潮霉素的培养基上成苗，而‘紫宝石’蝴蝶兰在此浓度下进行筛选，大部分原球茎不死亡，通过研究发现其适合的潮霉素浓度为50 mg/L→75 mg/L→75 mg/L→50 mg/L→无潮霉素的培养基上成苗，转化率达3.1%，比五唇兰（1.8%）高。

通过对随机选取的‘紫宝石’蝴蝶兰7个抗性植株进行PCR检测，GUS基因和潮霉素抗性基因均呈阳性，说明外源基因可能整合到了基因组内，至于是否能稳定遗传，还需要对试验植株的下一代进行进一步的验证。

参考文献

[1] Christenson E A. Phalaenopsis：A Monograph[M]. London：Timber Press，2001：39-291.

[2] 黄玮婷，曾宋君，吴坤林，等. 蝴蝶兰属植物杂交育种研究进展[J]. 热带亚热带植物学报，2012，20（2）：209-220.

[3] 朱根发. 蝴蝶兰种质资源及杂交育种进展[J]. 广东农业科学，2015，42（5）：31-38.

[4] 肖文芳，李 佐，尤 毅，等. 蝴蝶兰转基因研究进展[J]. 广东农业科学，2012，39（24）：168-170.

[5] Hsieh Y，Hsu T，Huang P. Studies on genetic transformation of Phalaenopsis by microprojectile bombardment[J]. Chinese Society for Horticultural Science，1995，41（3）：174-185.

[6] Chai M L，Xu C J，Belarmino M M，et al. Stable transformation of protocorm-like bodies in Phalaenopsis orchid mediated by Agrobacterium tumefaciens[J]. Scientia Horticulturae，1996，14（1）：213-224.

[7] Belarmino M，Mii M. Agrobacterium-mediated genetic transformation of a Phalaenopsis orchid[J]. Plant Cell Reports，2000，19（5）：435-442.

[8] Mishiba K I，Chin D P，Mii M. Agrobacterium-mediated transformation of Phalaenopsis by targeting protocorms at an early stage after germination[J]. Plant Cell Reports，2005，24（5）：297-303.

[9] 郝曜山，杜建中，孫 毅. 农杆菌介导转化蝴蝶兰遗传体系的研究[J]. 山西农业大学学报（自然科学版），2010，30（3）：205-208.

[10] 崔 波，牛苏燕，蒋素华，等. 农杆菌介导蝴蝶兰的遗传转化研究[J]. 河南农业大学学报，2013，46（6）：642-645.

[11] Teixeira da Silva J A，Chin D P ，Van P T，et al. Transgenic orchids[J]. Scientia Horticulturae，2011，130（4）：673-680.

[12] Hossain M M，Kant R，Van P T，et al. The application of biotechnology to orchids[J]. Critical Review in Plant Science，2013，32（2）：69-139.

[13] 简纯平，李开绵，欧文军. 花粉管通道法转基因育种研究进展[J]. 热带作物学报，2012， 33（5）：956-961.

[14] Yang S L，Li G L，Li M G，et al. Transgenic soybean with low phytate content constructed by Agrobacterium transformation and pollen-tube pathway[J]. Euphytica，2010，177（3）：375-382.

[15] 王 佳，曾宋君，陈之林，等. 子房注射法转化五唇兰的初步研究[J]. 热带作物学报，2013，34（8）：1 498-1 501.

[16] 刘其府，曾宋君，董 会，等. 农杆菌子房注射法对金钗石斛的活体转化研究[J]. 华南农业大学学报，2013，34（3）：378-382.

[17] Zeng S J，Chen Z L，Wu K L，et al. Asymbiotic seed germination，induction of calli and protocorm-like bodies，and in vitro seedling development of the rare and endangered Nothodoritis zhejiangensis Chinese orchid[J]. HortScience，2011，46（3）：460-465.

[18] Tsai C C，Chiang Y C，Huang S C，et al. Molecular phylogeny of Phalaenopsis blume （Orchidaceae） on the basis of plastid and nuclear DNA[J]. Plant Systematics and Evolution，2010，288（1）：77-98.

[19] World Checklist of Selected Plant Families[EB/OL]. http：//apps.kew.org/wcsp/home.do （2017-8-13）.

[20] 唐源江，叶秀麟，陈泽濂. 五唇兰雌配子体发育和胚胎发生的研究[J]. 热带亚热带植物学报，1998，6（4）：289-292.