截断逆挽方对慢加急性肝衰竭大鼠线粒体凋亡途径的影响

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摘要：目的 动态观察截断逆挽方对慢加急性肝衰竭（ACLF）大鼠线粒体凋亡途径的影响，探讨其作用机制。方法 SPF级Wistar大鼠随机分为正常组、模型组和截断逆挽方组，猪血清腹腔注射13周联合D-氨基半乳糖、脂多糖急性攻击建立ACLF模型。截断逆挽方组在急性攻击前予截断逆挽方灌胃3 d。各组大鼠于急性攻击后4、8、12 h平行取材。电镜观察肝细胞超微结构，免疫组化检测肝组织细胞色素C（Cyt C）表达，Western blot检测肝组织Bid蛋白表达。结果 与正常组比较，模型组4、8 h Cyt C和Bid表达量增加、12 h表达量减少（P<0.05）；与模型组比较，截断逆挽方组4、8 h Cyt C和Bid表达量减少、12 h表达量增加（P<0.05）。电镜观察显示，模型组大鼠肝细胞超微结构严重破坏，且程度逐渐加深，而各时间点截断逆挽方组大鼠肝细胞超微结构损伤程度较模型组均有所减轻。结论 截断逆挽方可有效降低ACLF大鼠肝细胞的损伤程度，其作用机制可能与阻断肝细胞线粒体凋亡途径有关。

关键词：慢加急性肝衰竭；截断逆挽方；线粒体；凋亡；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.012

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）04-0045-04

Effects of Jieduan Niwan Formula on Mitochondrial Apoptotic Pathway in Acute-on-Chronic Liver Failure Rats LI Jin-xia1， MU Ling-yun1， ZHANG Qiu-yun1， CHEN Yu2， GAO Lian-yin1， DU Yu-qiong1 （1. School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory Research， Beijing 100069， China； 2. Artificial Liver Center， Beijing You An Hospital， Capital Medical University， Beijing 100069， China）

Abstract： Objective To dynamically observe the effects of Jieduan Niwan Formula on mitochondrial apoptotic pathway in acute-on-chronic liver failure （ACLF） rats； To further reveal the possible mechanism of Jieduan Niwan Formula. Methods SPF Wistar rats were randomly divided into normal group， model group and Jieduan Niwan group. 13-week porcine serum injection followed with D-galactosamine and lipopolysaccharide joint acute attack was used to established ACLF model in all rats except for normal group. Rats in Jieduan Niwan group were orally given Jieduan Niwan Formula for 3 days before acute attack. Rats were sacrificed respectively at 4， 8 and 12 h after models were established. The expressions of Bid， Cytochrome C （Cyt C） and hepatocyte ultrastructure were detected by Western blot method， immunohistochemical analysis and transmission electron microscope， respectively. Results Compared with normal group， the levels of Cyt C and Bid in model group increased at 4 h and peaked at 8 h but decreased at 12 h （P<0.05）； however， the levels of Cyt C and Bid in Jieduan Niwan group were lower than those in model group at 4 and 8 h but higher at 12 h （P<0.05）. The ultrastructures were significantly damaged in model rats， which severity was escalated through time； in Jieduan Niwan group， the degree of injury decreased at each timing. Conclusion Jieduan Niwan Formula can efficiently alleviate the hepatocyte damage in ACLF rats， and the mechanism might be involved in the inhibition of the mitochondrial apoptotic pathway.

Key words： acute-on-chronic liver failure； Jieduan Niwan Formula； mitochondrion； apoptosis； rats

ACLF）是我国重大疾病重点研究对象之一，有进展迅速、病死率较高的特点，目前尚缺乏有效的预防和治疗措施[1]。肝细胞凋亡是ACLF的重要发病机制之一，研究表明，线粒体在细胞凋亡过程中扮演着极为重要的角色[2]。截断逆挽方是全国名老中医药专家钱英教授治疗ACLF的经验方，前期临床观察已显示其有效性，实验研究也表明其能降低ACLF模型大鼠死亡率、改善肝组织病理损伤并减少肝细胞凋亡[3-6]。本研究通过动态观察截断逆挽方对ACLF大鼠肝组织Bid、细胞色素C（cytochrome C，Cyt C）表达量及肝细胞超微结构的影响，进一步探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

雄性SPF级Wistar大鼠49只，鼠龄45 d，体质量180～200 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于首都医科大学实验动物部，自由饮食，温度（21±3）℃，湿度（50.2±2.0）%，12 h/12 h昼夜交替。

1.2 药物

截断逆挽方由苦味叶下珠30 g、瓜蒌30 g、金钱草30 g、生黄芪30 g、桑寄生30 g、三七6 g、生地黄20 g、莪术6 g、丹参20 g、黑附片15 g组成，饮片均购自北京同仁堂药店，水煎浓缩成4.34 g/mL，4 ℃保存，使用前37 ℃水浴加热。

1.3 主要试剂与仪器

D-氨基半乳糖（D-GalN），Inalco，P29/14/221；脂多糖（LPS），Sigma，109K4075；猪血清，北京平睿生物有限公司，20140713；Anti-Bid Antibody，Santa Cruz，J1413；Anti-Cyt C Antibody，CST，20140306；Anti-β-actin Antibody，CST，20140907。Eclipse 80i共聚焦荧光显微镜（Nikon），Universal 320R低温离心机（Hettich），1-14高速离心机（Sigma），F6/10超细匀浆器（Fluko），Model680酶标仪（Bio-Rad），165-8003垂直电泳仪（Bio-Rad），170-3930湿转电转仪（Bio-Rad），Odysseey2.1红外荧光扫描成像系统（LI-COR），JEM-1400高衬度投射电子显微镜（JEOL）。

2 实验方法

2.1 造模、分组及给药

49只大鼠随机分为正常组6只和造模组43只，造模组大鼠腹腔注射猪血清0.5 mL/（次·只），每周2次，共13周。正常组大鼠注射等量生理盐水。于13周末造模组随机抽取1只大鼠处死，取肝组织进行病理观察，根据《肝纤维化中西医结合诊疗指南》[7]判定免疫型肝纤维化造模是否成功。将成模大鼠随机分为模型组和截断逆挽方组（中药组），每组21只。中药组给予截断逆挽方4.34 g/mL浓缩液21.7 g/（kg·d）灌胃，连续3 d，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃。灌胃处理后，3组同时给予D-GalN 800 mg/kg联合LPS 100 μg/kg腹腔注射造成急性攻击，建立ACLF模型。各组大鼠分别于急性攻击4、8、12 h后进行平行取材，各组每个时间点取3只。大鼠麻醉后腹主动脉取血，摘取肝右叶同一部分置于10%福尔马林溶液固定，摘取相同部位乳头叶，切成1 mm3大小组织块，置于2.5%戊二醛中固定，余下部分于液氮中快速冻存。

2.2 免疫组化检测肝组织细胞色素C蛋白表达

10%福尔马林固定肝组织后进行石蜡包埋、切片，常规脱蜡、水化，微波抗原修复，10%正常羊血清封闭1 h，Cyt C单克隆抗体（1∶200）4 ℃过夜孵育，PBS洗涤后滴加HRP标记二抗37 ℃孵育1 h，DAB显色80 s，苏木素复染。各组每个时间点观察3张切片，随机选取10个高倍视野进行拍摄，并应用NIKON NIS-Elements BR软件进行阳性表达的标示及积分光密度（IOD）值检测。

2.3 Western blot检测肝组织Bid蛋白表达

各组每个时间点取5只进行匀浆、抽提总蛋白，按蛋白定量试剂盒说明测定提取液蛋白浓度。每例上样蛋白84 μg，经12%聚丙烯凝胶电泳分离后300 mA电转1 h至0.22 μm NC膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，根据所需分子量剪开膜后，分别予以β-actin抗体（1∶1000）、Bid抗体（1∶200）4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后加二抗（1∶5000）室温孵育1 h，红外荧光扫描成像系统扫膜。应用ImageJ2x 2.1.4.7软件检测蛋白条带灰度值，以β-actin作为内参对照，以目的蛋白灰度值÷内参蛋白灰度值计算Bid蛋白的相对表达量。

2.4 透射电镜观察肝细胞及线粒体超微结构

肝脏标本经由2.5%戊二醛及1%饿酸固定，经乙醇、丙酮脱水后，环氧树脂包埋、切片，饱和醋酸铀、枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察肝细胞及线粒体超微结构并拍照。

3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，方差齐时用LSD检验，方差不齐用Tamhane"s T2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 截断逆挽方对模型大鼠肝组织细胞色素C蛋白表达的影响

Cyt C蛋白被染成棕褐色，在细胞质表达。与正常组比较，模型组4 h Cyt C表达量明显增加，且随时间延长其表达逐渐增加，至8 h达到高峰，而12 h表达量则较前降低（P<0.01）；与模型组比较，中药组4、8 h Cyt C蛋白表达量明显降低（P<0.01），而至12 h其表达量则略高于模型组，其表达量随时间的推移呈现逐渐升高的趋势。结果见表1、图1。

4.2 截断逆挽方对模型大鼠肝组织Bid蛋白表达的影响

各组大鼠肝组织Bid蛋白表达的趋势与Cyt C蛋白表达基本相同。与正常组比较，模型组4 h时Bid蛋白表达量增加，至8 h达到高峰（P<0.05），至12 h表达量较前则降低；与模型组比较，中药组4、8 h Bid蛋白表达量降低，而12 h表达量则高于模型组（P<0.05），整体呈现逐渐升高的趋势。结果见表2、图2。

4.3 截断逆挽方对模型大鼠肝细胞及线粒体超微结构的影响

正常组大鼠肝细胞胞膜完整，胞质均匀，细胞核圆且居中，核仁明显，胞质内可见丰富的粗面内质网；线粒体形态多为圆形，大小为0.4～0.8 μm，嵴及双层膜结构完整。模型组4 h大鼠肝细胞肿胀，核染色质凝聚，可见大小不等的类圆形包涵体，脂滴增多，粗面内质网脱颗粒；线粒体增多、聚集，呈哑铃样改变，电子密度增高，嵴内腔扩张，嵴断裂。模型组8 h可见核变形，染色质边集，胞质空淡，内质网扩张，部分细胞内细胞器浓缩，形成高电子密度粗颗粒样凋亡小体，周围有空晕环绕；线粒体肿胀、聚集，基质中空，嵴乱而减少，并有膜包绕。模型组12 h肝细胞核皱缩呈不规则形或破裂，质膜破坏中断，Kupffer细胞侵入坏死细胞内吞噬凋亡小体，糖原增多，内质网及高尔基复合体膜断裂，产生大量髓鞘样结构；线粒体皱缩、空泡化，外膜破裂。较相对应时间点模型组，中药组肝细胞超微结构损害较轻，肝细胞核变形不明显，细胞基质尚存，至急性攻击后12 h，内质网扩张脱颗粒，但尚未降解，凋亡小体形成较少，炎性细胞浸润情况较轻，线粒体肿胀变形，但尚可见到一定的嵴，双层膜结构完整。见图3、图4。

5 讨论

肝细胞凋亡是ACLF的重要发病机制之一，其主要由2条途径介导，即死亡受体途径和线粒体途径[8]。前期研究结果显示，截断逆挽方能有效降低ACLF大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量及肝组织中caspase3、caspase8表达量，从而阻断死亡受体途径，减少肝细胞凋亡率，保护肝脏[3-6]。

有研究表明，线粒体是调控细胞凋亡的中心，近年来对细胞凋亡的研究已从聚焦细胞核的改变转向对线粒体呼吸链变化的研究。线粒体能够感受到细胞凋亡的信号，导致线粒体膜通透性改变（mitochondrial permeability transition，MPT），从而向细胞质中释放以Cyt C为主的多种凋亡诱导因子，在ATP介导下引起caspase家族级联反应，最终导致凋亡发生，因此Cyt C是线粒体启动凋亡程序的关键物质[8]。Cyt C的释放受Bcl-2家族蛋白的调节，目前已发现的Bcl-2蛋白家族可分为抗凋亡（Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡（Bax、Bad、Bid等）两大家族，其中Bid蛋白是近来研究的热点，Bid前体在caspase-8的激活下，形成截断的Bid（truncated Bid，tBid），tBid转位到线粒体，从而触发Cyt C的释放[9]。另有研究表明，线粒体途径和死亡受体途径还可以通过Bid蛋白连接起来，放大凋亡信号[10]。

本实验结果显示，模型组4～8 h Cyt C、Bid表达逐渐增加，提示线粒体途径的凋亡活动逐渐增多，并在8 h时达到高峰，而至12 h，Cyt C、Bid表达量呈降低的趋势，考虑此时肝细胞大量死亡，凋亡活动亦随之减少。经截断逆挽方干预大鼠4、8 h，Cyt C和Bid表达量较模型组有所降低，且其表达量4～12 h呈逐渐增加的趋势，并不存在一个上升又回落的过程，这提示我们截断逆挽方在抑制ACLF大鼠肝细胞线粒体途径细胞凋亡的同时又延缓了肝细胞死亡的过程。另外，通过电镜观察可以直观看到，模型组大鼠肝细胞超微结构遭到了严重的破坏，随时间的延长损伤程度逐渐加深，至12 h可见大量细胞凋亡坏死及炎性细胞浸润，而各时间点中药组大鼠肝细胞超微结构损伤程度较模型组均有所减轻，这种保护机制可能与阻断线粒体途径细胞凋亡有关。凋亡细胞的典型形态变化多有报道，但与凋亡有关的线粒体超微结构变化的报道相对较少。在本实验中，线粒体改变主要特征是肿胀，并伴有嵴断裂或消失，肿胀严重者成空泡化且外膜破裂，尤其在8 h其线粒体肿胀最为明显，而此时Cyt C及Bid表达最多，线粒体途径的凋亡活动最为活跃，由此推断，这种肿胀可能与MPT直接相关，可能有利于线粒体内外的物质和离子交换。而经截断逆挽方干预，大鼠线粒体肿胀及嵴断裂消失程度均有所减轻，意味着ACLF肝细胞凋亡过程中线粒体超微结构的变化与凋亡发生发展可能存在一定的相关性。

综上所述，截断逆挽方可有效减轻ACLF大鼠肝细胞的损伤程度，其作用机制可能与阻断肝细胞线粒体凋亡途径有关。

参考文献：

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[5] 吴文秀.截断逆挽方对慢加急性肝衰竭大鼠肝细胞凋亡的影响[D].北京：首都医科大学，2012.

[6] 崔丽娟.“截断逆挽方”对ACLF大鼠炎性细胞因子及肝组织病理变化的影响[D].北京：首都医科大学，2013.

[7] 中国中西医结合学会肝病专业委员会.肝纤维化中西医结合诊疗指南[J].中华肝脏病杂志，2006，14（11）：866-870.

[8] 王艳杰，邓雯，张鹏飞.细胞色素C与细胞凋亡研究进展[J].动物医学进展，2012，33（7）：89-92.

[9] ZHAI D， HUANG X， HAN X， et al. Characterization of tBid-induced cytochrome c release from mitochondria and liposome[J]. FEBS Lett，2000，472（2/3）：293-296.

[10] LI H， ZHU H， XU C J， et al. Cleavage of BID by Caspase-8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis[J]. Cell，1998，94：491-501.