腭突间充质细胞中TGFβ1信号通路介导维甲酸致腭裂的实验研究

材料与方法

1. 1 实验动物 8～10周龄的野生型C57BL/6J小鼠购自于广东省医学实验动物中心[许可证号SCXK（粤）2013-0002]。SPF级环境下饲养， 12 h光照， 12 h黑暗， 食物和水自由获取。交配当天晚上以雌雄2∶1的比例合笼， 次日早晨检测雌鼠阴道栓， 阳性者记为E0.5。

1. 2 RA诱导腭裂模型的构建 分别取E13.5（E13.5组）、E15.5

（E15.5组）和E17.5（E17.5组）的腭突， q-PCR检测TGFβ1基因的表达， Western blot检测下游p-Smad2（S467）的表达；RA购于上海sigma公司， 模型的构建参照先前的报道进行[2]。

1. 3 q-PCR检测 分别取各组的胚鼠， 于解剖镜下剪取腭突组织， 加入Trigene试剂提取总RNA， 用RE-TROscript逆转录试剂盒合成cDNA， 用q-PCR（SYBR green）检测的方法， 以β-actin为内参， 分析TGFβ1的基因表达水平。以上试剂均购自北京康润生物公司。

1. 4 Western blot检测 分别取各组的腭突组织， 于液氮中研磨成粉末， 加入RIPA裂解液[海门碧云天， 含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）， 150 mmol/L NaCl， 1% NP-40， 0.1% SDS和1 mmol/L PMSF]， 裂解充分后， 离心， 取上清， 用Western blot法检测下列TGFβ/Smad2信号通路蛋白的表达：p-Smad2（S647）、Smad2（武汉爱博泰克）， β-actin（天津三箭）。

1. 5 MEPM原代培养 原代培养参照前面报道的方法进行。简要过程如下：取E13.5正常胚鼠的上腭， 用显微剪剪下双侧腭突组织， Hank’s缓冲液漂洗后， 剪成约1 mm3大小的组织块， 用组织块贴瓶法进行培养。待间充质细胞爬出组织块并长至约80%覆盖度时， 进行第一次传代（P1）， 取P3～P5代细胞进行正式实验。细胞经处理后， q-PCR和Western blot检测如前所述进行。细胞活力检测（CCK-8法， 南京东仁化学）实验中， MEPM经RA（2 μm）和TGFβ1（2 ng/ml， 北京义翘神州）处理24 h后， 操作按照说明书进行。

1. 6 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；用qPCR分析基因相对表达量时， 数据转换为相对于对照组的倍数；用CCK-8分析原代细胞增殖时， 数据转换为相对于对照组的相对百分数， 两组间差异比较用独立样本t检验， 三组的组间差异比较用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 RA对小鼠体内腭突TGFβ1信号通路的影响 q-PCR结果显示， E15.5组的小鼠腭突中TGFβ1的表达较E13.5组显著升高， 到E17.5时又显著下降。而在RA组， E13.5组和E15.5组中TGFβ1的表达均较对照组显著下降（P<0.01）， 而到E17.5时， E15.5组和RA组TGFβ1的表达水平相当， 差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。表明RA抑制了腭发育关键时期（E13.5和E15.5）TGFβ1的表达。为了验证这一结果， 本次采用Western blot的方法进一步分析了TGFβ1信号通路下游的重要因子Smad2的活性。结果显示， 在E13.5和E15.5， RA组p-Smad2（S467）的表達均较对照组显著下降， 到E17.5时则与对照组基本相当， 差异无统计学意义（P>0.05）。以上结果表明RA抑制了腭发育关键时期（E13.5和E15.5）TGFβ1信号通路的活性。

2. 2 RA对体外培养的MEPM中TGFβ1信号通路的影响 q-PCR结果显示， RA显著抑制了MEPM中TGFβ1的表达， 且呈浓度依赖性。同样Western blot结果显示， RA显著抑制了MEPM中p-Smad2（S467）的表达， 且呈浓度依赖性。见图2。结果表明RA抑制了MEPM中TGFβ1信号通路的活性。

2. 3 体外添加TGFβ1逆转RA对MEPM增殖的抑制作用

CCK-8法结果显示， RA显著降低了MEPM的增殖活力（RA：2 μm， TGFβ1：2 ng/ml， 处理24 h）。为了探讨TGFβ1在RA抑制MEPM增殖中所扮演的角色， 在RA处理的MEPM中添加了TGFβ1重组蛋白。结果显示， RA和TGFβ1共处理组的细胞增殖活性较RA单纯处理组显著上升， 表明体外添加TGFβ1重组蛋白能有效逆转RA对MEPM细胞增殖的抑制作用。见图3。

3 讨论

小鼠腭的形成过程与人类非常相似， 是开展腭裂病因学研究的常用模型。正常小鼠腭的发育开始于E11.5， 在E12.5时腭突垂直向下生长， 一直持续至E13.5；在E14.5左右腭突上抬呈水平生长， 到E15.5时双侧腭突开始接触、粘附， 随后上皮细胞大量凋亡， 双侧腭突的间充质细胞相融合， 形成连续的上腭；到E17.5时腭完全融合形成一道屏障将口腔和鼻腔分开， 形成独立的口洞和鼻洞[3， 4]。可见， 腭的发育是由一系列复杂的过程组成， 并受多种信号通路的调控。在前期的研究中， 成功构建了RA诱导腭裂的小鼠模型， 并探讨了Wnt/β-catenin信号通路参与其中的分子机制[5， 6]。TGFβ信号通路也与腭的发育过程紧密关联。研究表明， 在腭的发育过程中， TGFβ1及其下游信号分子Smad2的表达具有时空特性， 在上皮细胞和间充质细胞的表达不同， 在不同腭发育时期的表达也不同。新近有研究显示， RA诱导腭裂的过程中腭突上皮细胞的TGFβ1信号通路出现异常[7-10]。但MEPM的TGFβ1信号通路在RA致腭裂中的作用尚不清楚。为此， 作者首先检测了RA诱导腭裂小鼠模型中MEPM TGFβ1的表达。在对照组， 从E13.5～E15.5， 间充质细胞的TGFβ1表达持续升高， 到E17.5时迅速降低， 这与腭发育过程中间充质细胞先扩增后分化的轨迹相吻合。同时， 从E13.5～E15.5RA组间充质细胞中TGFβ1的表达较对照组显著降低， 表明TGFβ1参与调控间充质细胞的增殖和分化。为了进一步分析间充质细胞中TGFβ1通路在RA致腭裂中的作用， 作者构建了间充质细胞体外培养模型， 发现RA能显著抑制MEPM中TGFβ1通路的活性， 同时呈浓度依赖性， 与体内结果一致， RA也显著降低了MEPM的增殖活性。体外添加TGFβ1有效逆转RA的抑制作用。这些结果一致表明， MEPM中TGFβ1信号通路在RA致腭裂过程中也发挥了重要的作用。对这一问题进行更加深入的研究， 将有助于进一步丰富对腭裂病因学的认识。

参考文献

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[8]沈璐， 丛蔚， 王如， 等. 维甲酸诱导腭裂相关wnt和成纤维细胞生长因子配体表达的动态变化. 华西口腔医学杂志， 2011， 29（1）：62-65.

[9]刘典伟. 叶酸对维甲酸诱导的腭裂小鼠的腭突间充质细胞增殖影响的研究. 山西医科大学， 2014.

[10]陈亦阳， 陈沐， 汪淼， 等. 胚鼠腭突细胞转化生长因子β3基因的RNA干扰及对TGFβ-Smad信号通路的影响. 中华口腔医学研究杂志电子版， 2011， 5（1）：16-21.

[收稿日期：2016-10-03]