摘 要 为研究广谱抗环斑病毒（PRSV）海南株系转基因番木瓜育种方案，采集海南番木瓜各主要种植区的PRSV株系，以外壳蛋白（CP）、辅助成分-蛋白酶（HC-Pro）和复制酶（Nib）基因作为靶标基因，通过序列比对和运用Clustalx软件分析，得到干扰基因的保守区域和挑选出海南PRSV典型株系的代表样品。以pUCCRNAi为骨架质粒，利用代表样品的CP、NIb、Hc-Pro基因片断保守序列构建RNAi发夹结构，将发夹结构导入pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体，构建出抗PRSV植物表达载体pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS、pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS、pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS。实验将PRSV不同株系保守序列的分析与RNAi的高效抗病设计理念相结合，可用于创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。
关键词 番木瓜；番木瓜环斑病毒；RNA沉默；基因转化
中图分类号 S432.41 文献标识码 A
Construction of RNAi Plant Expression Vectors with Broad
Spectrum Resistance to Hainan Papaya Ringspot Virus
ZHAO Hui1，2， ZHANG Yuliang2 *， KONG Hua2， JIA Ruizong2， ZHU Yun3，4
GUO Anping2， ZENG Huicai2， PENG Ming2 **
1 Agriculture College， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical
Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China
3 Hawaii Agriculture Research Center， Hawaii 96797， USA
4 University of Hawaii， Hawaii 96822， USA
Abstract The PRSV strains of main papaya planting areas in Hainan were collected for breeding transformation papaya resistant to papaya ringspot virus. The conserved interference regions of target CP， Hc-Pro and Nib gene were analyzed and the typical representative sample strain of Hainan PRSV was selected among them by sequence alignment and by Clustalx software. On the basic of pUCCRNAi vector， the conserved regions of target genes of typical sample was PCRed to construct RNAi hairpin structures. Then the RNAi hairpin structures were jioned into the plant expression vector pCAMBIA2300-35S-OCS. The broad spectrum PRSV resistant plant expression vector of pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS， pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS， pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS were constructed. Hanging the analysis of PRSV conservative sequence together with the design concept of RNAi high resistance， new germplasms with high efficient and broad virus resistant to Hainan PRSV could be created.
Key words Carica papaya； Papaya ringspot virus； RNA silencing； Genetic transformation
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.017
番木瓜（Carica papaya）是世界第四大热带、亚热带畅销水果，被世界卫生组织列为最有营养价值的十大水果之首[1]。番木瓜生产上最大的限制因子是番木瓜环斑病毒病（papaya ringspot virus， PRSV），已经被包括美国、南美、非洲、印度、泰国、台湾、中国、菲律宾、墨西哥、澳大利亚、日本、法属波利尼西亚、库克群岛等国家和地区确认为毁灭性病害，造成番木瓜大量减产，甚至在有的地区造成100%的损失[2]。抗PRSV转基因番木瓜已经在美国夏威夷和佛罗里达，以及中国广东商业化应用，并取得了良好的抗病效果，但由于抗PRSV转基因番木瓜序列同源性依赖的特性，限制了转基因番木瓜在不同地理区域以外的应用[3]。海南是中国最大的番木瓜生产地，由于番木瓜价格高，经济效益好，近年来海南番木瓜种植面积直线扩大，许多香蕉蕉园因香蕉枯萎病发生严重而改种了番木瓜，仅海南省香蕉主产区的乐东县最高峰时番木瓜种植面积达到6 667 hm2，但由于PRSV的影响2011年已经减少至2 667 hm2，2012年再减少一半变成1 333 hm2，至今海南仍没有能抗番木瓜环斑病的栽培品种[1]。
目前，利用RNAi技术转化番木瓜得到转基因种质与品种（系）的研究国内外尚未见报道。因此，本文利用抗PRSV有效的CP，Nib，Hc-pro基因片断构建单元或多元RNAi表达载体进行番木瓜转化（或共转化），将CP，Nib，Hc-pro基因保守序列分析与RNAi的高效抗病设计理念引入到番木瓜的抗病基因工程育种中，将获得高效、广谱抗PRSV的转基因品种（系）。
1 材料与方法
1.1 材料
以感染PRSV代表样品叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA[4]，用于目标基因片断PCR克隆；以pUCCRNAi为中间质粒构建发夹结构，植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS为骨架质粒，由CaMV 35S启动子驱动，章鱼碱合成酶基因的终止子（OCS 3′）终止，目标基因正反向片段插入位点之间由长201 bp基因内含子隔开。各种限制性内切酶购自Takara公司；TaqDNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自北京全式金生物科技有限公司；引物由广州立菲特生物科技有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 海南PRSV保守区域分析 在海南PRSV发生情况及分子鉴定的基础上[4]，以PRSV病毒基因组CP、Hc-Pro和NIb作为靶标基因，Blast比对GenBank数据库中的PRSV核苷酸信息，通过序列比对和运用Clustalx软件分析海南各株系间目标基因的保守区域，同时挑选出最具典型的海南PRSV的CP、Hc-Pro和NIb基因的代表样品。
1.2.2 海南PRSV CP、Hc-Pro和NIb基因保守区域干扰片段RNAi植物表达载体的构建
（1）具有粘性末端保守区域正反片断的获得。依据样品测序结果，找到CP、Hc-Pro和Nib为靶标干扰基因的保守区域，设计特异性引物，用高保真Taq酶进行PCR反应，在CP、Hc-Pro和NIb基因的正向片段分别引入XhoⅠ和BglⅡ酶切位点，在CP、Hc-Pro和NIb基因的反向片段分别引入BamHⅠ和SalⅠ酶切位点，引物序列见下。
CP正向序列：酶切位点XhoⅠ和BglⅡ。
PRSV-CP-RNAi-P1： 5′-CCCTCGAGTCAACGC
CGGAACTAGTGGAACTT-3′
PRSV-CP-RNAi-P2： 5′-GAAGATCTTCACGAG
CCCTATCAGGTGTCTTT-3′
基因大小544 bp。
CP反向序列：酶切位点SalⅠ和BamHⅠ。
PRSV-CP-RNAi-P3： 5′-GCGTCGACTCAACGC
CGGAACTAGTGGAACTT-3′
PRSV-CP-RNAi-P4： 5′-CGGGATCCTCACGAG
CCCTATCAGGTGTCTTT-3′
Hc-Pro正向序列：酶切位点XhoⅠ和BglⅡ。
PRSV-Hcpro-RNAi-P1： 5′-CCCTCGAGTGAAT
GCACGTAACATGAACGA-3′
PRSV-Hcpro-RNAi-P2： 5′-GAAGATCTACCAT
TTGCTGCCGAAACCTCT-3′
基因大小484 bp。
Hc-Pro反向序列：酶切位点SalⅠ和BamHⅠ。
PRSV-Hcpro-RNAi-P3： 5′-GCGTCGACTGAAT
GCACGTAACATGAACGA-3′
PRSV-Hcpro-RNAi-P4： 5′-CGGGATCCACCAT
TTGCTGCCGAAACCTCT-3′
NIb正向序列：酶切位点XhoⅠ和BglⅡ。
PRSV-NIb-RNAi-P1： 5′-CCCTCGAGCTTTGTA
TTGCCATTCACCCAGAT-3′
PRSV-NIb-RNAi-P2： 5′-GAAGATCTACTCATC
CATAGAACCACGCTCAC-3′
基因大小424 bp。
NIb反向序列：酶切位点SalⅠ和BamHⅠ。
PRSV-NIb-RNAi-P3： 5′- GCGTCGACCTTTGT
ATTGCCATTCACCCAGAT-3′
PRSV-NIb-RNAi-P4： 5′-CGGGATCCACTCATC
CATAGAACCACGCTCAC-3′
PCR反应体系25 μL，扩增条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR结束后，取5 μL产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
在紫外灯下，切割RT-PCR产物电泳条带，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京TianGen公司）回收目的基因片段。将其连接到pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取3～5个阳性克隆送广州立菲特公司测序。测序结果通过互联网进行Blast比对（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi），确定与已知病毒序列的同源性。运行Clustalx（v1.83）软件采用默认参数进行序列比对。
（2）发夹干扰载体的构建。将获得的两端带有XhoⅠ和BglⅡ位点的CP、Hc-Pro和NIb干扰片段PCR产物亚克隆到pMD18-T simple上，用XhoⅠ和BglⅡ进行双酶切，切下的片段连接到经同样双酶切的pUCCRNAi干扰载体上，构建成重组质粒pUCCRNAi-CP正、pUCCRNAi-Hc-Pro正、pUCCRNAi-NIb正。对这3个重组质粒进行XhoⅠ和BglⅡ双酶切，确定正向片断连接到pUCCRNAi载体上。
将CP、Hc-Pro和NIb基因反向干扰片段，用SalⅠ和BamHⅠ进行双酶切，切下的片段用T4连接酶连接到经同样双酶切的重组质粒pUCCRNAi-CP正、pUCCRNAi-Hc-pro正、pUCCRNAi-NIb正上，构建成pUCCRNAi-CP正反、pUCCRNAi-Hc-pro正反、pUCCRNAi-NIb正反RNA中间干扰载体。将上述重组中间干扰载体，用SalⅠ和PstⅠ进行双酶切鉴定。
用SalⅠ和PstⅠ双酶切具有发夹结构的中间干扰载体和植物表达载体，将发夹结构导入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS，经连接构建成植物表达载体。将构建好的番木瓜抗病毒植物表达载体pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS、pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS、pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS，用SalⅠ和PstⅠ进行双酶切鉴定。
2 结果与分析
2.1 海南PRSV保守区域分析
海南各主要株系保守序列分析图谱见图1所示，通过前期工作，测序了海南主要番木瓜环斑病毒76个疑似病毒样品，通过病毒序列比对，找到优势株系和共同保守区域的代表株系样品HN21。由图1中看出，代表样品具有海南PRSV功能基因的共同保守区域特点，可作为设计海南PRSV CP、Hc-Pro和NIb基因广谱抗病毒植物表达载体的模板。
代表样品测序结果通过互联网进行Blast比对（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi），结果海南番木瓜环斑病毒代表样品中CP、Hc-Pro、NIb基因（其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3），与美国夏威夷转基因木瓜病毒HA株系序列的同源性分别为90.20%、84.57%、84.25%，与台湾转基因木瓜病毒YK株系序列的同源性分别为92.65%、89.88%、92.18%。
2.2 具有粘性末端保守区域干扰片断的获得
带有粘性末端的保守区域引物PCR扩增出的正反干扰片断见图2所示，通过图2可看出，相关干扰片断大小与引物设计时的一致，说明干扰片断已被准确扩增。
2.3 干扰片断RNAi发夹结构的获得
将CP、Hc-Pro和Nib正向干扰片段用XhoⅠ和BglⅡ双酶切后连接到pUCCRNAi干扰载体上，重组质粒pUCCRNAi-CP正、pUCCRNAi-Hc-Pro正、pUCCRNAi-NIb正，经XhoⅠ和BglⅡ双酶切，分别切出与预期大小相一致的目的条带（图3），表明CP、Hc-Pro和NIb基因干扰片段已正向连到pUCCRNAi载体上。
反向干扰片段经SalⅠ和BamHⅠ双酶切，连接到经同样双酶切的重组质粒pUCCRNAi-CP正、pUCCRNAi-Hc-pro正、pUCCRNAi-NIb正上，重组正反向干扰载体经SalⅠ和PstⅠ双酶切鉴定，结果见图4，酶切片段与预期目的条带大小一致，表明CP、Hc-Pro和NIb基因干扰片段已正反向连到pUCCRNAi载体上。
2.4 番木瓜抗病毒RNAi植物表达载体的获得
构建好的番木瓜抗病毒植物转基因载体结构见图5。经SalⅠ和PstⅠ双酶切鉴定，结果见图6，酶切片段与预期目的条带大小一致，表明CP、Hc-Pro和NIb基因干扰片段已正反向连到植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS上。
3 讨论与结论
抗PRSV转基因番木瓜是第一次实际应用的抗病转基因水果作物，在抗PRSV转基因番木瓜中实际利用的抗病毒基因多来自病毒本身的基因，如病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因、核酶基因、辅助成分-蛋白酶基因等，其中外壳蛋白基因和复制酶基因的运用较为成功，辅助成分-蛋白酶基因的转化研究是提高转基因番木瓜抗病效果的重要研究方向。
大量实验发现转基因番木瓜病毒抗性主要来自于转录后基因沉默。台湾研究者将番木瓜PLDMV病毒台湾PTW-WF株系部分CP基因和PRSV台湾YK株系部分CP基因构建到同一载体转化番木瓜，得到的转基因植株能同时抗2种病毒，分子检测实验表明抗性植株的抗性主要来自转录后基因沉默[5]；为了得到抗福罗里达PRSV株系的转基因品种，佛罗里达大学的研究者将当地优势株系HIKCP基因的正义链、反义链、正义框架移动突变链、正义框架三联终止子添加链同时转化入雌性番木瓜中，病毒检测实验表明，4类转基因植株都有抗PRSV效果，后三类病毒抗性转基因植株无法翻译病毒CP蛋白，但能在RNA水平上通过RNA沉默机制抵御PRSV的感染[6-8]。
研究结果表明，表达载体构建的方式与基因沉默的效果有关。一般来说转病毒单链正义或者反义基因赋予植物的病毒抗性只有20%左右，正反向重复目的基因被内含子隔开时，其产生RNA沉默的效率最好，对病毒的抗性可高达90%[9]。张帆[10]等将PRSV CP基因的dsRNA载体pHG12-CPIR 分别转入拟南芥、烟草和番木瓜中，RT-PCR检测实验显示PRSV在野生型中有大量积累，而在转基因植株中没有积累。实验表明与CP、Nib基因不同，将病毒的HC-Pro基因正链转入寄主反而增强病毒的感染能力，不是理想的转基因抗病机制。HC-Pro能够强烈的局部干扰植物dsRNA前体形成siRNA或者是降低siRNA的稳定性，是一个强烈的局部沉默抑制因子。利用dsRNA介导的RNA沉默抗病毒机制，杨国峰等[11]构建了PRSV HC-Pro基因同源dsRNA的原核表达系统，并在番木瓜植株上喷洒dsRNA粗提液对番木瓜植株进行保护性处理和治疗性处理，保护性处理能有效诱发对番木瓜环斑病毒的抗性，表现为发病率低，发病时间晚，治疗性处理能在处理初期引起番木瓜环斑病毒积累量发生短暂降低。
发夹结构表达载体构建的方式极大影响基因沉默的效果，比如目标基因的选择，基因沉默片断的大小，发夹结构内含子的长短，转基因片断与沉默病毒的序列同源性等都与转基因植物抗性相关。前人研究结果表明，构建发夹结构目标基因片断的长度在200～600 bp转化后干扰效率最高，小于200 bp，大于600 bp效果不理想[12]，因此在理想范围内笔者选择了400～600间的片断进行克隆。近年来笔者对海南的PRSV病毒株系种类与分布在分子水平上进行了研究，进一步确认了海南的三类PRSV类型 （HainanⅠ，HainanⅡ， andⅢ），三种类型的PRSV在海南不同城市间分布不同，由于受达尔文和非达尔文选择的极大影响，海南PRSV具有极高的突变率[4]，因此在构建发夹载体时从分析克隆海南株系共同保守区域片断入手，使载体片断与海南各株系有最大的同源性，以期解决广谱抗病的问题。此外，为了分析同种病毒不同基因RNA介导的抗病毒效果，实验选择了3种抗PRSV较理想的基因（CP，Nib，Hc-Pro）片断构建载体。
RNA介导的抗性只需病毒RNA序列与靶序列同源，但当转基因序列和病毒基因序列的非同源性高于10%时，转基因就很难赋予植物抗病性[13]，因而特异性更强，为了获得广谱的病毒抗性，通过附加更多的病毒相关序列扩充转基因结构，能够使转基因植物获得更为广谱的抗性[14]。因此利用RNA 介导的抗性培育广谱、高抗性的抗PRSV番木瓜新品系， 在理论上是可行的， 结果将在实际生产中具有十分重要的经济意义。
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