背向散射积分评价自发性高血压大鼠左室心肌纤维化及苯那普利的干预作用

［摘要］ 目的 通过分析超声背向散射积分(IBS)参数的变化评价苯那普利对自发性高血压大鼠(SHR)左室心肌纤维化的影响。方法 14只雄性SHR随机分成模型对照组(SHR组，n=7)和药物干预组(SB组,n=7),另外选择7只雄性Wistar京都大鼠(WKY)作为正常对照组(WKY组)。SB组给予苯那普利灌胃(10 mg•kg-1•d-1)，WKY及SHR组给予等量蒸馏水灌胃。每周秤体质量，调节用药量。12周后超声测量左室射血分数（LVEF）、IBS参数(包括IBS%和CVIB)；对心肌组织进行Masson染色、嗜银染色及结缔组织生长因子(CTGF)免疫组织化学染色。结果 3组间比较IBS%值SHR组>SB组(P<0.01)>WKY组(P<0.05),CVIB值SHR组SB组>WKY组(均P<0.01)。IBS%与CTGF、CVF、PVCA、APFVF、T/D呈正相关。结论 高血压大鼠存在明显心肌纤维化，心肌CTGF表达增加；苯那普利能抑制CTGF的表达，在一定程度上逆转心肌间质纤维化，改善左室收缩功能。超声IBS技术可用于评价这种变化。

［关键词］ 声学密度定量技术；背向散射积分；苯那普利；自发性高血压大鼠；心肌纤维化；结缔组织生长因子；

［中图分类号］ R-33；R445.1［文献标识码］ A［文章编号］ 1671-7562(2008)03-0245-05

Study of the left ventricular myocardial interstitial fibrosis and effect of benazepril

in spontaneous hypertension rats by integrated backscatter technique

XUE Rui-feng1,SUN Shao-xian1, SUN Dong-mei1,SONG Wen-jing1，ZHANG Shu-hua2,XIE Fang2

(1.Department of Post-graduate,North China Coal Medical University， Tangshan 063000,China；2.Department of 

Ultrasound Diagnosis,Afiliated Hospital of North China Coal Medical University，Tangshan 063000,China)

Abstract: Objective To assess left ventricular myocardial interstitial fibrosisand effects of benazepril on spontaneous hypertension rat(SHR)by integrated backscatter(IBS)technique. Methods Fourteen SHRs were divided equally into two groups: intervening subject(SB)group and control subject(SHR)group. Other 7 WKYs were as the normal subjects(WKY).SB group were given 10 mg•kg-1•d-1 body weight of benazepril by intragastric administrstion,and WKY group and SHR group received 10 mg•kg-1•d-1 of distilled water. The animals were weighed once week to adjust for drug dosage. After 12 weeks, IBS%, CVIB, left ventricular ejection(LVEF)were determined.Masson staining and argyrophilic staining were used in the study of collagen volume fraction(CVF),perivascular collagen area(PVCA)，ratio of small coronary artery wall thickness to external diameter(T/D)and argyrophilic fibers volume fraction(APFVF)in heart tissue. The expression of CTGF was evaluated by qualitative and semiquantitative immunohistochemical staining. ResultsIBS% was greater in SHR group than SB group(P<0.01)and SB group greater than WKY group(P<0.05),while CVIB was lower in SHR group than SB groupand SB group less than WKY group(P<0.05). CTGF,CVF,PVCA,T/D,APFVF were increased in SHR group than SB group, while SB group greater than WKY group(all P<0.01). The correlations between IBS% and CTGF,CVF，PVCA， APFVF,T/D were significant. ConclusionsThe myocardial interstitial fibrosis in SHR is obvious. Hypertension induced the upregulation of CTGF in myocardium of rat. Benazepril can decrease the expression of CTGF and has good a effect on left ventricular myocardial interstitial fibrosis which contributes to reserve left ventricular systolic function.It is feasible to assess this change by IBS technique.

Key words： ultrasonic；integrated backscatter；benazepril；spontaneous hypertension rats；myocardial interstitial fibrosis；connective tissue growth factor

(Modern Meical Journal,2008,36:245-249)

超声背向散射积分(integrated backscatter，IBS)是一种重要的组织定征技术，是利用影像学手段无创而有效地评价心肌组织特征的诊断方法之一。此前研究表明，IBS能反映心肌组织的胶原含量［1］。而高血压病心肌纤维化正是由于心肌组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原组织过度沉积造成的。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是近年发现的与纤维化密切相关的细胞因子［2］。本研究用声学密度-背向散射积分(AD-IBS)技术检测心肌的IBS参数，结合免疫组织化学的方法检测CTGF的表达、Masson染色反映的胶原及血管情况、嗜银染色观察到的嗜银纤维变化,探讨苯那普利对自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rat，SHR)心肌纤维化的抑制作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及给药方法

14只7周龄雄性SHR和7只雄性Wister京都大鼠(WKY)(均购自上海高血压研究所)，体质量120～150 g。适应性喂养1周后，抽签法将SHR随机分成模型对照组(SHR组，n=7)和药物干预组(SB组,n=7)；7只WKY大鼠作为正常血压对照组(WKY组)。SB组给予苯那普利(溶于蒸馏水中)灌胃(10 mg•kg-1•d-1)，WKY及SHR组给予等量蒸馏水灌胃，持续12周。

1.2 试剂与仪器

苯那普利(北京诺华制药有限公司)，兔抗CTGF多克隆抗体(abcom公司，UK)；即用型第二代免疫组化Elivision TM plus广谱试剂盒、DAB显色试剂盒、Masson三色染色试剂盒及嗜银染色试剂盒(福州迈新生物技术公司);SONOS 5500超声诊断仪(HP公司)；图像采集系统(Olympus公司)；Motic Med数码医学图像分析系统(深圳麦克奥迪实业有限公司)。

1.3 超声检查

大鼠经腹腔注射10%水合氯醛(350 mg•kg-1)麻醉后，取左侧卧位。应用HP SONOS 5500超声诊断仪，S8探头，经胸壁作心前区探测。测定常规心功能(左室射血分数，LVEF)后，启动声学密度(AD)定量系统，获得满意的左室长轴及乳头肌水平左室短轴切面，将连续2.48 s内62帧图像存入磁光盘。脱机后，将感兴趣区(ROI，11×11像素点)置于左室后壁中间段的心肌层及心腔内，随心动周期运动。分别得到心肌声学密度参数：平均图像强度(AII，即IBS)；峰峰强度(PPI,也即背向散射积分周期变化值，CVIB)；图像背向散射的标准差(SDI)。计算心肌校正IBS(IBS%)，IBS%=心肌层的IBS值/心腔IBS值。

1.4 标本采集

超声检查完毕后行腹主动脉放血处死动物，取出心脏，置入10%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片厚度4～5 μm，用于组织形态学观察(Masson染色、嗜银染色及免疫组织化学染色)。

1.5 胶原纤维染色

应用Masson三色法进行胶原染色，心肌细胞呈红色，胶原呈蓝色。Foot法嗜银染色显示嗜银纤维呈黑色或黑褐色，心肌细胞呈红色。应用Motic Med数码医学图像分析系统测量心肌胶原容积分数(CVF)、血管周围胶原面积(PVCA)及冠脉小动脉管壁厚/管外径值(T/D)。计算方法：CVF＝胶原面积/总面积，其中胶原面积不包括血管周围胶原面积(与嗜银纤维容积分数APFVF测量相同);PVCA＝壁内小动脉管腔周围胶原面积/该小动脉管腔面积。每项染色各组取14张切片，每张切片随机取5～10个视野，取其平均值。

1.6 CTGF的蛋白表达

应用免疫组织化学染色法测定。将涂有防脱剂(APES)的石蜡切片常规脱蜡至水，柠檬酸高压抗原修复。3％过氧化氢孵育10 min，滴加第一抗体CTGF工作液，浓度1∶600，4 ℃过夜。滴加聚合物增强剂作用20 min、酶标抗兔/鼠聚合物作用30 min，再加显色剂(DAB)显色3～5 min，复染，分化，脱水和封片。阳性反应为棕黄色颗粒状物质沉积。应用PBS替代第一抗体的方法作为阴性对照。采用医学图像分析系统，每组取14张切片，每张切片按顺序选12～20个200倍显微镜视野图像，测定阳性细胞的平均积分光密度，取其平均值。

1.7 统计学处理

全部数据均以Excel建库，通过SPSS 13.0软件包进行统计学分析。所有数据均以x-±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用非配对t检验,相关性用Pearson线性相关分析,P＜0.05为差异有统计学意义。



2 结果

2.1 超声指标的变化

常规超声心动图检测结果显示，WKY组和SB组的LVEF值均在正常范围，SHR组与其他两组比较增高显著(P＜0.01)。左室后壁中部心肌的IBS%值SHR组>SB组(P＜0.01)>WKY组(P＜0.05)；CVIB水平SHR组

2.2 Masson三色染色及嗜银染色结果

WKY组大鼠胶原沉积主要在心肌壁内冠状小动脉外膜，很少向周围间质延伸，在心肌间隙中胶原沉积较少。SHR组血管壁明显增厚，T/D明显增加，血管周围胶原密度增加，且较长距离延伸至间质中；肌间隙中的胶原增多，不规则排列，紧裹心肌细胞(图2)。嗜银染色示嗜银纤维呈网状分布在心肌纤维周围，SHR组明显增多增粗，所包绕的心肌纤维粗细不均，排列紊乱。SB组病变明显减轻，但未达正常水平(图3)。

2.3 3组大鼠心肌纤维化指标及心肌组织中CTGF表达比较

心肌纤维化指标CVF、PVCA、T/D及APFVF 3组间比较均为SHR组＞SB组＞WKY组(均P＜0.01)。见表2。

心肌组织中CTGF阳性颗粒主要在心肌细胞及血管平滑肌细胞的胞浆及核膜表达。在正常健康WKY大鼠心肌及冠状小血管平滑肌有少量表达，而在SHR大鼠心肌和血管平滑肌可见大量的棕黄色物质表达。CTGF表达SHR组>SB组>WKY组(均P<0.01)。见图4。

2.4 相关性分析

相关分析结果显示，IBS％与CVIB呈负相关(r=-0.568，P<0.01),与CTGF、CVF、PVCA、T/D、APFVF呈正相关(r=0.689，0.463，0.612，0.469，0.627,均P<0.05)。CTGF与CVIB呈负相关(r=-0.589，P<0.01)，与CVF、

3 讨论

SHR是一种遗传性高血压模型，此模型与人类高血压性心脏病具有类似的心脏几何构形变化，符合高血压病的病理生理过程。苯那普利系血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，临床上广泛用于高血压、冠心病、糖尿病的治疗，但其机制未完全阐明，对CTGF的影响报道较少［3］。IBS技术通过分析心肌背向散射信号变化对心肌结构和物理特性进行量化分析，能够无创地评价心肌细微结构变化。本实验是利用IBS技术评价苯那普利对SHR左室心肌纤维化及CTGF表达的影响，以探讨苯那普利抑制心肌纤维化的可能机制。

正常人心肌IBS时间强度曲线为随心动周期有规律的变化曲线，似正弦波，舒张末期IBS值最大，收缩期逐渐下降，至收缩末期最小，而后又逐渐升高。IBS偏重于反映静力学变化(心肌组织学如纤维化、水肿、坏死等改变)，其值不受心脏前、后负荷及心肌收缩力的影响。而代表心肌背向散射积分周期变异幅度的CVIB偏重于反映动力学变化(与心肌收缩力相关的变化如肌节长度、肌纤维方向等)，与收缩功能有关［1］。在高血压情况下，由于心肌间隙及血管周围纤维化，血管壁增厚,嗜银纤维增多、增粗，造成散射原排列紊乱，感兴趣区散射原密度增多，从而引起IBS增加。另外，由于间质纤维化，嗜银纤维增多、增粗，血管壁增厚，可使心肌氧弥散距离增大，虽然心肌细胞代偿性肥大，但由于局部心肌细胞坏死增加使收缩单位减少，可使心肌舒张收缩功能减低。由于常规LVEF检测的是短轴缩短率，忽略了长轴的舒缩功能，而不能全面反映左室功能。在高血压早中期，LVEF可代偿性增加。而CVIB可以反映局部收缩功能，早于LVEF发现收缩功能的降低。本实验结果显示，IBS％与纤维化指标CTGF、CVF、PVCA、T/D、APFVF呈正相关，说明IBS％可以反映心肌纤维化程度。SHR组IBS%较正常WKY组明显增高，苯那普利干预后减轻，Masson染色及嗜银染色结果也显示纤维化程度减轻，说明苯那普利可以减轻心肌纤维化。在SHR组CVIB较正常减低，苯那普利治疗后可使之升高，说明苯那普利可以改善心肌收缩功能。

CTGF是近年发现的一种致纤维化细胞因子，广泛存在于人类多种组织器官，如心、肺、肾和结缔组织中，其异常表达与多种类型纤维化疾病进展密切相关。心肌组织中CTGF主要由心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和浸润的炎症细胞分泌［4］。生理情况下，CTGF基础量表达。本研究结果显示，与健康WKY组相比，SHR组CTGF的表达明显增高，苯那普利干预后CTGF的表达明显下降，纤维化程度也同时减轻，说明高血压的心肌纤维化可能与CTGF的高表达有关。苯那普利可以通过减轻CTGF的高表达改善心肌纤维化。目前有学者将CTGF列入器官纤维化的主要指标之一［5］。CTGF可能是治疗纤维化疾病更为有效和安全的新靶标。

综上所述，SHR有明显的心肌纤维化，心肌组织CTGF高表达，苯那普利可能通过降低CTGF的高表达减轻心肌纤维化，并改善左室收缩功能。IBS技术可以准确反映大鼠心肌组织纤维化变化，可用于评价心肌纤维化程度及药物疗效，有望成为临床上评价纤维化的重要方法。

［参考文献］

［1］李华，万征，黄灿亮.超声背向散射技术的基础研究与临床应用［J］.中国医学影像学杂志,2004,12(3):218-220.

［2］吴芳,杨方.结缔组织生长因子与心肌纤维化［J］.心脏杂志,2006,18(6):715-717.

［3］董志恒，李才，曲萌.糖尿病大鼠心肌CTGFmRNA的表达及苯那普利的调节作用［J］.中国病理生理杂志，2004，20(8):1501-1503.

［4］Finckenberg P,Merasto S,Louhelainen M,et al.Magnesium supplementation prevents angiotensin Ⅱ-induced myocardial damage and CTGF overexpression［J］.J Hypertension,2005,32(2):290-300.

［5］Rueperez M,Lorenzo O,Blanco-Colio L M,et al.Connective tissue growth factor is a mediator of angiotensin Ⅱ-induced fibrosis［J］. Circulation, 2003, 108(12): 1499-1505.

［收稿日期］2008-02-21