痰热清注射液对肺癌患者外周血淋巴细胞免疫活性的影响

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D�m��`�]��.�AD��V���"http://www.lysspx.com/p/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料与方法

1.1细胞株、试剂与药物

人肺癌细胞株A549及白血病细胞株K562均由河北医科大学第四医院科研中心提供;痰热清注射液（上海凯宝药业有限公司）;顺铂注射液（齐鲁制药有限公司）;小鼠抗人CD3-ECD，CD4-FITC，CD8-PE，CD25-PE，CD3-FITC，CD16+56-PE（Beckman公司）;植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）及MTT（Sigma公司）;胎牛血清（杭州四季青公司）;RPMI1640培养基（Gibco公司）;乳酸脱氢酶（LDH）释放法杀伤活性检测试剂盒（南京建成生物技术有限公司）;PCR反转录及扩增试剂盒（Promage公司）。

1.2肺癌患者及健康人外周血淋巴细胞的分离

无菌采取经病理诊断证实Ⅲ～Ⅳ期肺腺癌初诊患者及健康人外周血，肝素抗凝，加入等体积PBS混匀，用Ficoll淋巴细胞分离液（ρ为1.077）经密度梯度离心法，分离单个核细胞（peripheralbloodmono-nuclearcell，PBMC），1500r·min-1离心15min，取白细胞层用PBS洗涤2次，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，用于后续实验。

1.3观察指标

1.3.1MTT法检测痰热清注射液对肺癌患者外周血淋巴细胞增殖活性的影响

上述肺癌患者淋巴细胞分离后，以2×10^/1个/孔接种于于96孔板中，以PHA25g·L-1作为刺激源，阴性对照组不加入痰热清注射液，只加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，实验组每孔分别加入0.2，0.5，0.8，1.5μL痰热清注射液，反应体系均为200μL，对应浓度分别为1.0，2.5，4.0，7.5mL·L-1，以健康人淋巴细胞加入PHA作为阳性对照组，各组反应体系均为200μL，每组均为5个复孔，刺激48h后，MTT法用酶标仪检测培养体系在492nm处吸光度A以反映外周血淋巴细胞增殖水平。

1.3.2ELISA法检测痰热清注射液对肺癌患者外周血淋巴细胞分泌IFN-γ，TNF-_α的影响

收集方法1.3.1中各实验孔培养上清，ELISA法检测阴性对照组、阳性对照组、加入1.0，4.0mL·L-1痰热清注射液组培养上清中IFN-γ，TNF-_α的含量，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3流式细胞术（flowcytometry，FCM）检测痰热清注射液对肺癌患者外周血淋巴细胞各亚群比例的影响

取方法1.2项制备的淋巴细胞，加入六孔板中，每孔5×10^/1个淋巴细胞，分组同1.3.1，培养体系均为2mL，每组5个复孔，培养48h后，调整细胞浓度为1×10^/1个/mL，分为3管，分别加入20μLCD3-ECD，CD4-FITC，CD8-PE;20μLCD3-FITC，CD16+56-PE;20μLCD4-FITC，CD25-PE。室温避光孵育30min，加入破膜剂，裂解红细胞后，流式细胞术检测外周血CD3^/1，CD3^/1CD4^/1，CD3^/1CD8^/1T细胞，CD3-CD16+56^/1NK细胞及CD4^/1CD25^/1T细胞比例。

1.3.4反转录PCR（RT-PCR）检测痰热清注射液对肺癌患者外周血淋巴细胞表达Foxp3mRNA水平的影响

取方法1.3.3项中1×10^/1个各组淋巴细胞，常规两步法提取细胞总RNA，进行RT-PCR。实验分组同1.3.3项，cDNA序列根据Genebank设计PCR扩增引物序列，Foxp3引物：上游5′-CTGACCAAGGCTTCATCTGTG-3′，下游5′-ACTCTGGGAATGTGCTGTTTC-3′，扩增片段长度为176bp;β-actin引物：上游5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，扩增片段长度为205bp。基因表达差异分析，RT-PCR扩增产物相对表达量的强弱用目的基因的灰度与相应反应条件下β-actin的灰度的比值来表示。

1.3.5LDH释放法检测痰热清注射液对肺癌患者外周血CTL及NK细胞杀伤活性的影响

1.3.5.1CTL细胞的培养及杀伤活性的检测取5×10^/1个对数期生长的A549细胞，用丝裂霉素作用后，与2×10^/1个方法1.2项中制备的淋巴细胞共培养，实验分为4组，阴性对照组：采用肺癌患者淋巴细胞与A549细胞共培养;阳性对照组：采用正常人淋巴细胞与A549细胞共培养;实验组：采用肺癌患者淋巴细胞与A549细胞共培养，同时体系中分别加入1.0，4.0mL·L-1痰热清注射液。培养体系均为5mL，在37℃，5%CO₂培养箱中培养72h，培养体系中同时均加入IL-250U·mL-1，培养后收集细胞并调整细胞的浓度为2×10^/1个/mL作为效应细胞，取对数生长期的A549细胞作为靶细胞，并调整细胞的浓度为1×10^/1个/mL备用。每组均为5个复孔，每孔分别加入100μL效应细胞（E）和100μL靶细胞（T），（E/T=20∶1），在饱和湿度37℃，5%CO₂培养箱中培养48h。培养结束后，取每孔培养上清液10μL加入酶标板中，测定孔和测定空白孔各取5μL。用酶标仪于波长450nm测吸光度A。参考文献[4]并按下列公式计算细胞的杀伤活性，细胞杀伤活性=（A测定孔-A空白孔）/（A对照品孔-A对照空白孔）×100%。

1.3.5.2NK细胞杀伤活性的检测取方法1.2项中制备的淋巴细胞，调整细胞的浓度为2×10^/1个/mL作为效应细胞，取对数生长期的K562细胞作为靶细胞，并调整细胞的密度为2×10^/1个/mL备用。实验分组及杀伤率计算公式均同1.3.5.1，每孔加入100μL效应细胞（E）及50μL靶细胞（T）（E/T=20∶1），实验组每孔同时加入0.2，0.8μL痰热清注射液，浓度分别为1.0，4.0mL·L-1，每孔均为200μL体系，不足部分用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基补齐，在饱和湿度，37℃，5%CO₂培养箱中培养48h。LDH释放法检测NK细胞的杀伤活性。

1.4统计学方法

采用SPSS13.0统计学分析软件进行统计分析和处理，结果用±s表示，计数资料样本间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异为有统计学意义。

2结果

2.1痰热清注射液对肺癌患者外周血淋巴细胞增殖活性的影响

与阳性对照组相比，阴性对照组淋巴细胞增殖活性明显减低（P<0.01），而加入不同浓度痰热清注射液可明显促进淋巴细胞增殖水平（P<0.05），且具有一定的剂量依赖性（图1）。

2.3痰热清注射液对肺癌患者外周血淋巴细胞各亚群比例的影响

与阳性对照组相比，阴性对照组CD3^/1T细胞、CD3^/1CD4^/1T细胞及CD3-CD16+56^/1NK细胞比例均明显减低，CD4^/1CD25^/1调节性T细胞比例明显增高（P<0.01）。而与阴性对照组相比，加入痰热清注射液组CD3^/1T细胞、CD3^/1CD4^/1T细胞及CD3-CD16+56^/1NK细胞比例均明显增高（P<0.05），而CD4^/1CD25^/1调节性T细胞比例明显减低（P<0.01）（表1）。

2.4痰热清注射液对肺癌患者外周血淋巴细胞表达Foxp3mRNA水平的影响

阳性对照组淋巴细胞Foxp3mRNA的表达水平为（0.189±0.048），阴性对照组表达水平为（0.523±0.067），表达水平明显增高（P<0.01），而加入1.0，4.0mL·L-1痰热清注射液组Foxp3mRNA表达水平分别为（0.342±0.053），（0.211±0.029）均较阴性对照组明显减低（P<0.01）（图3）。

2.5痰热清注射液对肺癌患者外周血CTL及NK细胞杀伤活性的影响

与阳性对照组相比，阴性对照组CTL及NK细胞杀伤活性均明显减低（P<0.01），而加入1.0，4.0mL·L-1痰热清注射液组，CTL及NK细胞杀伤活性均较阴性对照组明显增高（P<0.05）（图4）。

3讨论

淋巴细胞是介导机体抗肿瘤及抗感染适应性免疫应答的主要效应细胞，其通过共刺激分子等信号的活化作用而发挥免疫效应^[5-6]，晚期肺癌患者淋巴细胞免疫功能显著低于健康人，主要表现为淋巴

细胞对丝裂原刺激增殖活性的减低、分泌活化性细胞因子能力的下降、CTL及NK细胞杀伤活性的减弱等。这些作用可能与肿瘤细胞的直接接触或其分泌的抑制性细胞因子如IL-10，TGF-β有关^[7-8]。近来，痰热清注射液对机体抗肿瘤细胞免疫功能的影响备受关注^[2]，本研究通过体外实验，研究了痰热清注射液对晚期肺癌患者外周血淋巴细胞免疫活性的促进功能，结果发现各项指标均有所改善。

本研究以非特异性丝裂原PHA作为刺激源，研究了痰热清注射液对肺癌患者外周血淋巴细胞增殖活性的影响，结果显示，加入不同浓度痰热清注射液可明显促进淋巴细胞增殖水平，且该作用具有一定的剂量依赖性，痰热清注射液对肺癌患者淋巴细胞增殖活性的促进作用有助于其自身细胞免疫功能的提高。另外，进一步采用了ELISA实验检测细胞因子的变化，结果表明，该作用可能与其促进淋巴细胞分泌Th1类细胞因子IFN-γ及TNF-_α有关，这2类细胞因子可通过多种机制介导机体抗肿瘤免疫应答^[9-10]。因此，痰热清注射液可能通过促进IFN-γ，TNF-_α的表达而增强淋巴细胞抗肿瘤免疫活性，进而改善整个肿瘤机体免疫抑制的状态。

淋巴细胞介导机体抗肿瘤免疫应答的作用主要由T细胞及NK细胞等完成，而CD4^/1CD25^/1调节性T细胞为一类具有免疫抑制作用的淋巴细胞，对维持免疫耐受极为重要[6，10-11]。正常情况下，T细胞中各亚群比例保持在一定范围内，而恶性肿瘤患者T细胞各亚群比例明显异常[5，9]，主要表现为CD3^/1T细胞、CD3^/1CD4^/1T细胞比例减低，CD3^/1CD8^/1T细胞和CD4^/1CD25^/1调节性T细胞比例的增高，同时NK细胞比例亦明显减低。本研究结果显示，单独培养的肺癌患者淋巴细胞中CD3^/1T细胞、CD3^/1CD4^/1T细胞及NK细胞比例均明显低于健康对照组，CD4^/1CD25^/1T细胞及调节性T细胞的重要标志Foxp3mRNA^[12]表达水平均明显高于健康对照组，而与痰热清注射液共培养组淋巴细胞各亚群比例均有明显改善，同时Foxp3mRNA表达水平也明显下降，这提示痰热清注射液可能具有纠正肿瘤造成的T细胞亚群紊乱，并下调CD4^/1CD25^/1调节性T细胞的表达作用，从而增强淋巴细胞的抗肿瘤细胞免疫应答活性。

此外，本研究还研究了该药对肺癌患者CTL细胞及NK细胞的杀伤活性，结果显示，与痰热清注射液共培养的CTL及NK细胞杀伤活性均明显高于阴性对照组。CTL是介导适应性抗肿瘤细胞免疫应答的主要的效应细胞，NK细胞对肿瘤细胞的非特异性杀伤活性在机体抗肿瘤免疫应答中也占有重要地位，二者杀伤活性的强弱直接反应机体对肿瘤细胞的免疫监视功能^[13-14]。所以，通过促进CTL及NK细胞的杀伤活性而增强肺癌患者机体的抗肿瘤免疫功能，可能是该药发挥免疫正向调节作用的机制之一。

综上所述，本实验研究了痰热清注射液对肺癌患者淋巴细胞免疫功能的调节作用，结果显示痰热清注射液可明显改善肺癌患者淋巴细胞的免疫抑制状态，增强机体抗肿瘤免疫力。因此，本研究为痰热清注射液在肺癌综合治疗中的应用提供了新思路，在临床上可能具有更广阔的应用空间。

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[责任编辑张燕]