基因芯片技术在肺纤维化致病基因的研究现状和进展

基因芯片技术是分子生物学与微电子技术、高分子化学合成技术、激光技术、信息科学技术和计算机技术等学科交叉融合而成的－种新技术，是伴随着人类基因组计划的实施而发展起来的前沿生物技术，这个时期预示着21世纪是生命科学取得重大突破的世纪，在医学领域中疾病的基因诊断和基因治疗、干细胞克隆治疗、器官克隆、基因疫苗等医药高科技成果将深刻地改变人类的生活方式和健康水平。

1 基因芯片的概念及分类

1.1 基因芯片的概念　基因芯片的概念来自计算机芯片，它的实质是在面积不大的基片表面上有序地点阵排列了－系列固定于－定位置的可寻址的识别分子，结合或反应在相同条件下进行，反应结果用同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪或CCD(电荷藕合器件)摄像技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读的Ic总信息。经激光共聚显微镜扫描，以计算机系统对荧光信号进行比较和检测，并迅速得到所需的信息。基因芯片技术，比常规的实验方法效率高几十到几千倍，可在－次实验中间平行分析成千上万个基因。是－种进行DNA序列分析和基因表达信息分析的强大工具。

1.2 基因芯片的分类　根据其制造方法可分为原位合成法和合成后点样法。根据所用载体不同可分为玻璃芯片、硅芯片等；根据载体上所固定的DNA种类可分为dDNA和寡核苷酸芯片两种；根据其用途可分为测序芯片、表达谱芯片、诊断芯片等。近年来，已经研究出以各种结构微阵列芯片，如生物电子芯片、药物控释芯片、通道型微阵列芯片、基因扩增芯片、集成DNA芯片、生物传感器芯片等。

2 基因芯片在医学上的应用

2.1 基因表达分析　生物芯片技术可用于快速进行激素、药物和其他小分子作用机制的研究，还可以进行转录因子、激酶、生长因子、细胞因子、受体和其他基因产物的功能研究。生物芯片主要用于基因测序工作和基因表达分析方面的研究，测定和识别细胞系和组织间有差异表达的基因是现代生物学研究的－个重要内容。

2.2 单核苷酸多态性(sNP)的测定单核苷酸多态性(sNP)是指基因组内特定的核苷位置上存在两种不同的碱基，其中最少－种在群体中的频率不少于1％。Chee等应用包含135 000种探针的基因芯片，检测了16.6 kb的人类线粒体基因组中的SNP位点，从这10个样品中，检测出多达505个SNP标志位点。

2.3 克隆选择及文库筛选　生物芯片可用于人体特定组织或器官的cDNA文库的研究，将cDNA文库中的克隆扩增后以点阵形式固定在杂交膜上，选用特定的探针系统与之杂交，以杂交信号的强弱为检测依据，就可以快速、低廉、高效地对－个大容量的cDNA文库中代表不同基因的cD.NA克隆进行分类和分析。

2.4 基因芯片技术在基因突变检测中的应用　人类基因组大约由3×109个核苷酸组成，机体在内外环境因素作用下，有些基因会受到损伤而发生变异。相对于传统的诊断策略，基因诊断的优点在于它是在基因水平上反映异常.因此能以更高的灵敏度对疾病进行早期诊断，更有利于疾病的及时防治。

2.5 在疾病研究方面的应用　疾病的发生常常伴随基因图谱的改变，基因芯片技术可以同时检测－种疾病状态所影响的数千条基因表达的精度变化。有专家研制的多肿瘤系统检测蛋白芯片.可同时检测12种肿瘤标志物。Stingley等使用75种寡聚核苷酸对单纯疱疹病毒在不同感染下病毒基因表达情况的研究，有利于探讨疱疹病毒的转录机制。

2.6 基因芯片在疾病诊断方面的应用 基因芯片技术可以在－张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测，为疾病的早期诊断提供了－个新的领域。有人用寡核苷酸芯片和生物素标志的扩增样品进行杂交，结果显示基因芯片在肝炎病毒检测中的高敏感性和分辨率。Li等利用基因芯片技术对流感病毒感染细胞的PCR扩增产物进行分析，成功鉴别出了甲型、乙型流感病毒并进行了分型。2003年，我国在SARS领域第－个综合诊断芯片问世。

3 基因芯片对肺纤维化的研究现状和进展

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是－种以普通型间质性肺炎(usual interstitial pneumonia.UIP)为特征性病理改变的慢性炎症性间质性肺疾病，主要表现为弥漫性肺泡炎，肺泡单位结构紊乱和纤维化，局限于肺部，主要以肺泡间质炎性细胞(单核或巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞)浸润、纤维母细胞增生和肺泡间质纤维结缔组织沉积为特征的免疫介导的慢性炎症性疾病，是许多病因不同的肺问质疾病的共同结局。

肺纤维化的发病机制不完全清楚，目前认为它是肺损伤、免疫反应、炎症反应和纤维生成4个要素的综合作用，而且这4个要素的作用是平行发生的，反映在组织病理学征象上表现为很高的均质性。英国有25例的家族性IPF病例报道.诊断时患者年龄较非家族性病例显著为轻，而其他方面则无明显差异；另有报道至少在－个家族中发现IPF是由于第14号的基因遗传的。提示遗传因素在肺纤维化发生发展中也有重要的作用，可能存在对该疾病的易感基因。谢保松等用基因芯片技术研究普通型肺纤维化的表达谱，结果显示在UIP肺组织中TRAF5、LITAF和MCP—l基因表达明显上调。TNF—d诱导的核因子－KB(NF—KB)活化主要是通过TRAF5信号传导途径介导的。Has-ton等用含7000基因克隆的基因芯片技术观察实验性小鼠肺纤维化早期基因表达谱的变化，发现有已知的200余种基因异常，涉及肺组织细胞分化、结构形态、信号转导、机体防御、代谢、线粒体基因及目前－些尚未知功能的基因。利用基因芯片技术在基因水平诊断肺纤维化和过敏性肺炎的研究结果显示，IPF在组织重塑、上皮细胞和肌纤维母细胞相关基因上调有关，而过敏性肺炎在炎性T细胞活化和免疫反应相关基因的上调有关。基因芯片技术测定结果显示，用争光霉素建立的肺纤维化模型中有两个不同的基因簇表达增加，认为这些基因有可能是对肺部炎症的调节基因，在－个基因簇中有38个基因是已知的炎症调节基因，另外25个基因有可能与炎症的调节功能有关，另－个基因簇包括66个基因，它们与第－个基因簇的在炎症的病理过程中的表达呈－个基线，但却比第－个基因簇优先诱导，这些基因簇编码42种蛋白，这些蛋白与间质组分、间质反应基因、组织重塑的调节基因有关，结果还显示大多数已知的TGF—B诱导基因存在于这2个基因簇上并有诱导肺纤维化形成的功能。有专家在对肺纤维化的不同的临床阶段的基因芯片研究中发现，在肺纤维化的快速进展阶段，有些功能通路明显上调，这些通路似乎影响了－些在肺上皮细胞和肺间质细胞中起作用的分子机制以及－些涉及细胞流动性和肌成纤维细胞的分化、氧化应激反应等有关的基因。在快速进展阶段，有许多基因发生了改变，证实并定位了其中2条相关基因，－个是阿糖腺酐A2B受体基因，它与人类肺成纤维细胞向肌纤维母细胞的分化有关，是肺纤维化重塑的关键，另－个是prominin－1／CDl33基因，这是在造血于细胞和胚上皮中发现的基因。有人对百草枯诱导的肺纤维化的基因时空表达的研究显示，在对PQ诱导的不同时间阶段有大量的基因出现不同的表达变异，在细胞膜通道、转运通道、神经递质受体在肺纤维化期都被诱导表达，特别是转化生长因子TGF—B3受体表达增加，这个因子被认为在肺纤维化中起到了决定的作用。而TGF—Bl在实验的各个时间点都没显示上调表达。Liu等用基因芯片技术发现在肺纤维化中.FIZZI的表达明显上调。在体外培养的肺成纤维细胞中未检测到FIZZl，但是，将表达FIZZl的Ⅱ型肺泡上皮细胞和成纤维细胞共同培养，成纤维细胞d—actm’和I型胶原的表达增强，这种作用不依赖于TGF—B，将表达FIZZl的质粒转入成纤维细胞中，其q—aelin和I型胶原的表达明显增强.此结果提示FIZZI在肺纤维化成肌纤维细胞的分化中起作用。Liu等于2004年9月报道，IL－4／IL－13可能通过STAT－6途径参与FIZZI的调控而参与肺纤维化。

生物芯片技术虽然处在“幼年阶段”，但已展示出它的潜在广阔应用前景，人们明白，在21世纪中许多生物化学反应，将在芯片上进行。目前，基因芯片技术正被我们广泛地应用于肺纤维化的发生发展过程的研究和通过基因表达谱的分析来认识肺纤维化的发病机制，为肺纤维化的诊断和治疗提供了科学依据。今后研究人员将利用基因芯片表达谱芯片技术对肺纤维化进行基因群水平研究，筛选在肺纤维化相关的多个环节上起重要作用的分子和起关键调节作用的基因，以揭示肺纤维化在基因水平上的本质。肺纤维化是个多基因、多环节、多途径参与的过程，可能涉及影响不同生化途径多群遗传因子表达的改变，随着基因芯片技术的发展，我们可以展望在未来能彻底地了解肺纤维化的发病机制，并应用基因芯片技术获得化学药物在肺纤维化疾病的分子谱，筛选出对肺纤维化有效、安全的药物。