酵母分泌表达重组人神经生长因子

摘要：目的研究人神经生长因子基因工程制备工艺。方法构建了表达质粒pPIC9K/rhNGF，转化毕赤酵母，筛选多拷贝转化子，进行摇瓶表达，正交试验选择表达条件。结果得到高表达高外泌的工程菌，并确定了纯化步骤，经疏水层析和阳离子交换层析纯化后，取得高活性高纯度的rhNGF。结论为该药的规模生产奠定了基础。

关键词：重组人神经生长因子；毕赤酵母；分泌表达

中图分类号：Q786文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)01-0009-03

Expression and Secretion of Recombinant Human Nerve Growth Factor in Yeast

WANG Ge, WANG Yan, SUN Hai-bo, HE Ling-bing, ZHU Yi-song, WANG Jun-yan

(Shandong Younglong Biotech. Co., Ltd., Jinan 250101, China)

Abstract：Objective To study the genetic preparation of human nerve growth factor (hNGF). Methods The efficient expression plasmid was constructed and transformed into Pichiapastoris, which was applied for screening of multicopy converter and expression with shake flask by orthogonal test. Results The engineering strain with high-level expression and secretion was obtained. Fermentation and purification was performed by hydrophobic chromatography and basic ion exchange laminar analysis in order to obtain pure and active recombinant human nerve growth factor (rhNGF). Conclusion The study lays a foundation for the large-scale production of rhNGF.

Key words：rhNGF;Pichiapastoris; expression and secretion

人神经生长因子（human nerve growth factor， hNGF）是人体中一种对正常神经细胞有营养作用，对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因子，它可维持交感神经和感觉神经的生存，促进神经细胞的分化，决定轴突的伸展方向[1]。对促进大脑的发育、神经系统的生长、损伤神经的再生和功能恢复具有决定性作用。hNGF可应用于糖尿病性周围神经病变、老年痴呆症、帕金森氏症、面神经炎及神经损伤（包括周围神经损伤）等神经系统疾病，是目前唯一可应用于临床的神经系统蛋白质因子。hNGF在人体中含量甚微，天然来源几乎不可能。因此，用基因工程的方法生产重组人神经生长因子（rhNGF）是唯一的选择[2]。为此，我们尝试了将人神经生长因子基因在酵母中的表达。

1材料和方法

1.1菌株

通过全基因合成得到人神经生长因子（hNGF）的全基因片断[3]，将该基因片段插入到含有AOX1启动子和分泌信号肽序列的载体pPIC9K中，构建了重组表达质粒pPIC9K/rhNGF，转化PichiapastorisGS115宿主菌。通过比较转化子在MM和MD平板上的生长状况，筛选His+ Mut+表型转化子，并在2.0 mg/mL G418平板上筛选得到多拷贝转化子[4]。摇瓶培养，甲醇诱导外源基因表达，表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析[5]，结果表明重组蛋白质相对分子质量13.6×103，能与特异性抗体发生免疫反应；鸡胚背神经节法测rhNGF活性[6]，结果显示表达活性可达104 U/mL。

1.2方法

1.2.1蛋白表达条件的优化根据影响酵母表达的各种关键因素（表1），设计了正交试验选择表达条件。

表1 酵母表达正交试验的各关键因素及试验水平

1.2.2工程菌的发酵培养及蛋白表达取液氮保存甘油管菌株，取适量无菌操作涂布于YPD平板上，30 ℃条件下倒置培养活化24 h。取活化平板上3～5个单菌落，接于BMG摇瓶，30 ℃，200 r/min摇床培养24ｈ。以0.5％比例转接入二级BMG培养基，30 ℃摇床200 r/min培养24 h，当菌密度达1.0～1.3时，以10％比例接于有BMG培养基的发酵罐中，30 ℃条件下发酵培养，溶氧（dissolved oxggen, DO）控制在30％，pH为6.0。期间流加甘油。甘油消耗完毕，菌密度达到200以上，DO急剧变化时，开始补加甲醇诱导表达，通过甲醇量控制DO在30％～40％，甲醇残余不超过1％，补充NH3H2O控制pH 5.6～5.8，诱导表达60ｈ。

1.2.3蛋白的纯化将发酵液在低温条件下离心，发酵上清超滤浓缩后，经C4-Sepharose疏水层析和CM-Sepharose层析纯化，即得rhNGF。

2结果

2.1酵母表达正交试验结果

根据实验结果，选择的较佳表达条件是：发酵温度28～30 ℃，甲醇诱导浓度为1.0％～0.8％，发酵pH 5.6～5.8，诱导表达60 h后收集发酵液上清。最高外泌表达活性可达104 U/mL。

2.2rhNGF的表达及活性测定结果

取甲醇诱导60ｈ的发酵液，做SDS-PAGE和生物学活性检查。电泳结果见图1。

图1 酵母分泌表达蛋白质SDS-PAGE图

1.表达后的上清液；2.标准样品；M.标准蛋白marker

电泳结果表明，工程菌表达分泌rhNGF量约为每升发酵液50 mg，约占外泌蛋白的50％。活性测定结果表明，分泌蛋白的活性约为每毫升培养液104 U。

2.3蛋白纯化结果

M 1 2 3

图2纯化过程SDS-PAGE分析

1.疏水纯化样品；2.阳离子交换纯化样品；3.标准品；M.标准蛋白marker

电泳结果显示，该酵母表达系统表达的rhNGF，经疏水层析和阳离子交换层析纯化后，纯度可达到95％以上，见图2。2步纯化后的样品活性大于105 U/mg。

2.4免疫印迹实验结果

将纯化后的rhNGF进行Western blot杂交分析，结果与抗NGF抗体呈阳性反应，见图3。

１ ２

图3免疫印记实验结果

1.阳性对照；2.纯化样品

3讨论

目前NGF在临床上试用于治疗周围神经损伤、糖尿病性周围神经病变、化学试剂或药物引起的神经中毒等神经系统疾病，疗效显著，是迄今唯一可能应用于临床治疗的神经系统蛋白质因子。但是由于NGF3个链内二硫键影响折叠的原因，用传统的基因工程方法获得大量rhNGF有相当的困难[3]。

美国在应用基因工程的方法生产rhNGF方面已取得很大进展，可是他们在临床适应证的研究上颇费周折。最近，我国SDA批准了鼠源NGF上市，用于治疗化学中毒引起的神经疾病；但基因工程方法生产rhNGF还未取得突破。

用基因工程方法制备hNGF重组蛋白，本实验室曾以大肠杆菌和ＣＨＯ细胞进行表达尝试均未获得活性产物。我们将hNGF蛋白在毕赤酵母中外泌表达，克服了rhNGF无天然活性的问题，表达产物分泌于胞外，有利于下游的纯化。该研究为rhNGF规模生产和临床应用打下良好基础。也为同类产品的研发提供了技术平台，有利于其它难表达基因产品的制备开发。

参考文献

[1]Kenneth E, Miller E, Seiger A . Nerve growth factor-induced stimulation of dorsal root ganglion/spinal cord co-grafts in oculo: enhanced survival and growth of CGRP-immunoreactive sensory neurons[J]. Cell Tissue Res, 1999, 298:243-253.

[2]Ullrich A, Gray A, Berman C, et al. Human β-nerve growth factor gene sequence highly homologous to that of mouse[J]. Nature, 1983, 303:821-824.

[3]王革. 用新的复性方法制备重组人神经生长因子：中国，ZL001 11220.1[P]. 2005-09-21.

[4]王革. 用酵母分泌表达重组人神经生长因子：专利申请号02135794.3[P].

[5]金冬雁，黎孟枫. 分子克隆实验指南[M]. 第2版，北京：科学出版社. 1999：880-885.

[6]王军志. 生物技术药物研究和质量控制[M]. 北京：科学出版社，2002：475-479.

注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”