摘要:为研究温度对鲤鱼(Cyprinus carpio)口服免疫后免疫应答规律的影响,试验设定了两个温度梯度,并测定了各温度梯度下鲤鱼口服免疫迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)药饵后,鱼体内血清抗体效价、血清γ球蛋白含量和血清γ球蛋白百分比、血液嗜中性粒细胞吞噬活性、溶菌酶活性和超氧化物歧化酶的活性的变化。结果表明:25 ℃低温组抗体效价自第28 天显著高于30 ℃高温组,低温组γ球蛋白含量第14 天高于高温组,在56 d有极显著差异。温度能显著影响鲤鱼嗜中性粒细胞的吞噬、溶菌酶和SOD活性,低温组除嗜中性粒细胞的吞噬活性显著低于高温组外,溶菌酶和SOD的活性均显著高于高温组。
关键词:温度;鲤鱼;免疫指标;口服免疫
中图分类号:S965.116文献标识码:A DOI编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.05.014
Effect of Temperature on Immunization Response of Common Carp with Oral Immunization
LIU Yu-lan, XING Ke-zhi, DONG Shao-jie, YANG Guang
(Department of Fishery Science ,Tianjin Agricultural College,Key Laboratory of Aquatic Ecology and Aquaculture of Tianjin, Tianjin 300384, China)
Abstract:Antibody titer, γ globulin percent, γ globulin content, phagocytic activity of neutrophil and activities of LSZ and SOD in the serum of common carp under two kinds of temperature were determined to study effective of temperature on immunization response of common carp with oral immunization. The results showed that the antibody titer of low temperature group was obviously higher than high temperature group from 28 day. γ globulin content of low temperature group was higher than high temperature group and up to obvious level at 56 day. The temperature could affect significantly phagocytic activity of neutrophil and activities of LSZ and SOD. Phagocytic activity of low temperature group was lower than that of high temperature, however, activities of LSZ and SOD at the lower temperature were higher obviously than that at higher temperature.
Key words: temperature; common carp; immunization response; oral immunization
在鱼类的疾病防治中,免疫学方法是被普遍推崇的手段之一,但多数疾病的免疫防治效果尚不令人满意[1]。影响鱼类免疫应答的因素较多:抗原接种方法是重要的影响因子之一,注射免疫效果明显,但有众多弊端,口服免疫方便、安全的优势被人们认可[2],但抗原在动物消化系统的降解及免疫系统的呈递会一定程度上影响免疫应答反应;此外,环境温度也是极为重要的影响因子,在临界温度之上,体液免疫随温度的增加而增加,低于临界温度,体液免疫受抑制或者反应很低。Newma[3]的研究发现,虹鳟的免疫球蛋白M(IgM)属于温度依赖型,在一定程度上佐证了鱼类体液免疫受温度影响的特点。非特异性免疫指标可能与特异性免疫相反,在低温环境下,非特异性防御发挥重要的作用,从而弥补特异性免疫应答的不足[4]。
为了探讨鲤鱼口服免疫应答反应的规律,本试验研究了两种温度条件下,定期投喂添加灭活细菌的饲料后,鲤鱼部分非特异性免疫应答反应指标的变化。
1材料和方法
1.1试验用菌及疫苗制备
试验用迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus Fleming)购于农业部渔业动植物病原库。细菌经24 h培养后,用灭菌生理盐水(0.85%)洗下,并调整密度至1×1010 cfu/mL,以终浓度为0.3%的福尔马林灭活细菌(28 ℃、48 h)。将灭活迟缓爱德华氏菌液按1∶1比例与1%羧甲基纤维素混合后喷涂于浮性饲料表面,制成药饵。
1.2试验鱼及饲养条件
试验鲤鱼均质量(30±11)g,为天津市鲤鱼良种试验场自繁自养。将随机挑选的健康试验鱼160尾,随机分为4组,分别养殖于直径1.2 m,水深 0.5 m的圆形水泥桶中。加热棒控制水体温度,使试验组Ⅰ、Ⅱ为(25.5±1)℃,Ⅲ、Ⅳ组为(30±0.5)℃。
试验期间早晚投饲,并在试验的第3周开始投喂药饵(30 g/组,折合菌投喂量为1×109 cfu/(尾·d),持续1周,投饲1 h后及时清除残饵。每隔4～5 d置换充分曝气的等温水体(总体积1/3),使水体溶氧维持在3.5 mg/L以上。
1.3血样采集与处理
药饵开始投喂前、后间隔两周,从各试验桶中随机捞取鲤鱼6尾,尾动脉采血1.5 mL,其中0.3 mL制备抗凝血,其余部分提取血清备用。
1.4非特异免疫指标测定
1.4.1嗜中性粒细胞吞噬活性0.3 mL抗凝血中加入120 μL甲醛灭活溶壁微球菌(A600=0.500),混匀后28 ℃孵育30 min,间隔15 min时混匀1次。孵育后离心(500×g,5 min),取白细胞层涂片,瑞氏染色后显微计数嗜中性粒细胞及吞噬细菌量。吞噬活性用吞噬百分比(Phagocytic percentage,PP)和吞噬指数(Phagocytic index, PI)表示:
1.4.2溶菌酶活性溶菌酶活性测定参照朱壮春等[5]的方法,并稍作调整:用0.067 mol/L,pH=6.64磷酸盐缓冲溶液 (PBS)将灭活融璧微球菌配制成一定浓度(A500=0.320±0.005) ,取3 mL菌悬液与50 μL待测血清混合,37.0 ℃反应30 min,测定反应前后混合溶液的吸光值(分别为A0和A)。溶菌酶活力(U)按下式计算:U=A0-A0 。
1.4.3超氧化物歧化酶(SOD)测定邻苯三酚自氧化速率以及标准酶和样本SOD酶活力单位过程参考董海胜[6]的方法:2.5 mL 50 mmol/L Tris-HAc(pH=8.20,含1 mmol/L EDTA-2Na)和一定体积三蒸水混合,25.0 ℃预热10 min,加入V1 mL 4.5 mmol/L 邻苯三酚,混匀后立即测定325 nm处初始值和1 min后的吸光值,二者之差即为邻苯三酚自氧化速率ΔA325/min,测定标准酶和样本SOD酶活力单位时同时加入一定体积邻苯三酚(V1)和样液或标准液(V2),立即测ΔA325/min。反应总体积为4.5 mL,V1和V2根据邻苯三酚自氧化速率和样液抑制率调整,总体积由三蒸水调节。为简化试验操作过程,参考邹国林等[7]方法将超氧化物歧化酶酶活力单位与抑制率线性化,大大节约试验时间。
1.5试验数据处理
试验数据用SPSS 13.0统计软件,显著性检验采用独立样本学生-T检验,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。
2结果与分析
2.1养殖温度对嗜中性粒细胞吞噬活性的影响
鲤鱼口服免疫前后嗜中性粒细胞吞噬活性变化见表1。经过为期56 d的养殖试验,两个温度组吞噬指数在免疫后都有增加,14 d时达到最高水平,之后急剧下降,甚至比免疫前还低,到56 d又回到免疫前水平;吞噬百分数受口服免疫的影响不大。温度影响鲤鱼口服免疫后细胞吞噬活性,免疫后42 d低温组吞噬指数显著低于高温组(P <0.05),吞噬百分数有极显著差异(P <0.01)。
2.2养殖温度对溶菌酶活性的影响
不同温度条件下,鲤鱼口服免疫前后溶菌酶活性变化趋势见表2。在为期56 d的养殖试验中,低温组在第28天检测到溶菌酶最高值(0.054 1 U),高温组则在第14天出现最高值(0.050 4 U),低温组在投喂后28 d和56 d极显著高于高温组(P<0.01)。
2.3养殖温度对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响
酶活力单位常用对数与抑制率直线方程为y = 0.646 1x - 0.583 7(R2 = 0.996 6),抑制率在17%～77%范围有很好线性关系。根据以上标准曲线公式,计算出的不同养殖温度下,鲤鱼口服免疫前后SOD活性变化趋势见表3。两组SOD活性在免疫后都有降低,42 d后又逐渐增加。低温组分别于14 d和28 d分别极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)高于高温组。
3讨论
迟缓爱德华氏菌是鱼类(鳗、鲇、鲆等)、两栖类(蛙)、爬行类(鳖、鳄鱼)的重要致病菌之一,给水产养殖业带来巨大经济损失[8]。水产养殖业中,采用免疫接种方式提高养殖动物体液免疫应答水平和对相应致病菌保护率的研究很多,该方法不仅可以显著提高动物抗体效价,对血清SOD活性、溶菌酶活性,白细胞吞噬活性和攻毒存活率也有显著激活作用[9-12]。Salati[13]研究发现,爱德华氏菌灭活菌体、细胞碎片和细胞提取物、LPS等作为抗原均显示出良好的免疫效果,本研究结果显示,口服免疫对鲤鱼嗜中性粒细胞吞噬指数、溶菌酶活性有一定激活作用。灭活爱德华氏菌口服免疫鲤鱼后,分别在14 d和28 d出现最大值,表明口服免疫对其非特异性免疫指标具有一定的刺激作用。爱德华氏菌对非特异性免疫的激活作用可能是其细胞壁的内毒素发挥作用。众所周知,细菌内毒素对机体既有毒性,也有免疫激活作用,内毒素首先作用于机体的单核巨噬细胞,诱导细胞分泌多种介质分子,低含量的介质对机体有益,可起到免疫激活作用;高含量的介质对机体有害,可导致机体高热、低血压、弥漫性血凝,甚至休克、死亡等严重后果。
温度作为鱼类最重要的环境因素之一,几乎可影响机体所有生命活动。机体的生命活动离不开各种酶促反应,这些反应都有最适温度。在最适温度下,酶活性最高;低于或高于最适温度,酶活性受不同程度抑制。本试验结果显示,温度对鲤鱼口服免疫后嗜中性粒细胞吞噬、溶菌酶和SOD活性有显著影响,除吞噬活性表现出低温组低于高温组,溶菌酶和SOD都表现出低温组活性高于高温组。河蚬溶菌酶活性和SOD在13～30 ℃养殖温度下逐渐上升,25℃时比30℃时高[14],而本研究的这两种酶在25℃养殖温度下比30℃的高,这些差异表明,不同生物体具有不同性质的溶菌酶和SOD,这是物种长期进化中产生的,对机体非特异性免疫意义重大[15]。
参考文献:
[1] Yang X L. Advance on fish immunology research [J]. J Fish China,1989,13(3):271-284.
[2] Newman S G.Bacterial vaccines for fish[J]. Annual Review of Fish Diseases,1993 (3):145-185.
[3] 侯亚义,韩晓冬.温度和类固醇激素对虹鳟免疫球蛋白M(IgM)的影响[J].南京大学学报:自然科学,2001,37(5):563-568.
[4] 翁朝红,谢仰杰.环境因素对鱼类免疫功能的影响[J].集美大学学报:自然科学版,2001,6(2):184-188.
[5] 朱壮春,史宇平,张淑杰,等.中药复方Ⅱ对鲤鱼生长和免疫功能的影响[J].水利渔业,2008,28(2):100-102.
[6] 董海胜,陈斌.利用修改的Marklund方法测定SOD活性[J].保鲜与加工,2009, 50(1):27-29.
[7] 邹国林,陈东明,程林,等.超氧化物歧化酶活力测定曲线的线性化研究[J].武汉大学学报:自然科学版,1996,42(6):779-782.
[8] 王波,莫照兰.迟缓爱德华氏菌及其致病机理[J].海洋科学集刊,2007(48):133-139.
[9] Takuya I, Shinobu W,Hiroshi K. Humoral immune response of carp (Cyprinus carpio) induced by oral immunization with liposome-entrapped antigen[J].Developmental and Comparative Immunology,2003(27):413-421.
[10] Lavelle E C, Jenkins P G, Harris J E. Oral immunization of rainbow trout with antigen microencapsulated in poly(DL-lactide-co-glycolide) microparticles[J].Vaccine,1997,15(10): 1070-1076.
[11] 陈宇,戚少燕,程起群,等.草鱼口服出血病疫苗的免疫途径及效果[J].安徽农业科学,2000,28(2):247-248,251.
[12] 王高学,白冰.9种细菌成分及其代谢产物对鲫鱼免疫功能的影响[J].西北农林科技大学学报,2006,34(2):39-44.
[13] Salati F,Kawai K,Kusuda R.Immuno response of eel against Edwardsiella tarda antigens[J].Fish Pathology,1983,18(3):135-141.
[14] 徐钢春,顾若波,闻海波,等.环境胁迫对河蚬溶菌酶和超氧化物歧化酶活性的影响[J].安徽农业大学学报,2007,34(1):74-78.
[15] 唐啸尘,丁燏. 美国红鱼血清溶菌酶性质及其应用[J].渔业现代化,2008,35(4):51-54.
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