下面是小编为大家整理的2023年临床微生物检验基本技术标准（2023年）,供大家参考。
目 次 前言 ..................................................................................................................................................................... II 1 范围 ................................................................................................................................................................. 1 2 规范性引用文件 ............................................................................................................................................. 1 3 术语和定义 ..................................................................................................................................................... 1 4 无菌操作及消毒灭菌技术要求 ...................................................................................................................... 2 5 标本处理及制片技术要求 ............................................................................................................................. 3 6 染色技术要求 ................................................................................................................................................. 4 7 显微镜检查技术要求 ..................................................................................................................................... 4 8 接种技术要求 ................................................................................................................................................. 5 9 培养技术要求 ................................................................................................................................................. 7 10 鉴定技术要求 ............................................................................................................................................... 8 11 分子检测技术要求 ..................................................................................................................................... 11 12 免疫学检测技术要求 ................................................................................................................................. 12 13 质量保证 ..................................................................................................................................................... 12 参考文献 ............................................................................................................................................................. 15 1 临床微生物检验基本技术标准 1 范围 本标准规定了医学实验室在临床微生物检验领域的基本技术要求。本标准适用于开展临床微生物检验的医学实验室。
2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
GB 19489 实验室生物安全通用要求 WS/T 442 临床实验室生物安全指南 WS/T 639 抗菌药物敏感性试验的技术要求 WS/T 497 侵袭性真菌病临床实验室诊断操作指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。
3.1 消毒 disinfection 杀灭或清除物体上活的病原微生物的方法。
3.2 灭菌 sterilization 杀灭物体上所有微生物（包括细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物）的方法。
3.3 无菌 asepsis 指不存在活菌。
3.4 无菌操作 aseptic operation 防止微生物进入人体或无菌物品、无菌区域的操作。
3.5 接种 inoculation 将目标微生物转移至适于生长繁殖的人工培养基或活的生物体内的方法。
3.6 荧光淬灭 fluorescence quenching 指由于荧光分子与其他分子发生作用而出现的光度降低、发光时间缩短乃至停止发光的现象。
3.7 2 一套血培养 a set of blood culture 从同一个穿刺点采集的血液，通常分别注入一个需氧血培养瓶和一个厌氧血培养瓶进行血培养。
3.8 微生物培养 microbial culture 利用人工培养基和适宜的培养条件（如温度、气体环境等），使微生物生长繁殖的技术。
3.9 细菌鉴定 identification of bacteria 以细菌系统分类学为原则，通过一系列的方法，将未知细菌归到一定种属的过程。
4 无菌操作及消毒灭菌技术要求 4.1 无菌操作技术要求 对各类标本进行采集、接种等过程及对已生长的微生物进行血清凝集、鉴定和药敏试验等操作时需要进行无菌操作。无菌操作技术要求包括：
a) 接触培养标本的所有器材必须经过灭菌处理；
b) 稀释标本或制备菌液的液体必须经过灭菌处理；
c) 用于微生物培养的各类培养基在使用前应保证无菌生长；
d) 接种标本或转种菌株应将接种环(针)加热灭菌，或使用一次性无菌接种环（针）；
e) 打开容器挑取标本或培养物后，应尽快盖回盖子，防止他们被污染或造成交叉污染；
f) 用加样器和吸头从试管中吸取体液标本或菌液时，应注意加样器勿接触管壁。
4.2 消毒灭菌技术要求 临床微生物实验室常用的消毒与灭菌技术及要求见表1。
表1 临床微生物实验室常用的消毒与灭菌技术及要求 待消毒灭菌对象 化学法消毒与灭菌技术 物理法消毒与灭菌技术 工作台面和地面 一般采用含有效氯 400 mg/L～700 mg/L 的消毒液，作用 30 min；
经血传播病原体、结核分枝杆菌等，采用含有效氯 2000 mg/L 的消毒液，作用>60 min。
紫外灯辐照强度应不低于 70 µW/cm2 ，安装紫外灯的数量≥1.5 W/m3 ，照射时间≥30 min。
实验室空气 无人状态下：
1）3％过氧化氢，或 5000 mg/L 过氧乙酸，或 500 mg/L 二氧化氯等喷雾；
2）15％过氧乙酸水溶液（7 mL/m3 ）或二氧化氯（10 mg/m3 ～20 mg/m 3 ）或臭氧（20 mg/m 3 ）熏蒸。
无人状态下，紫外灯消毒：紫外灯辐照强度应不低于 70 µW/cm2 ，安装紫外灯的数量 ≥1.5 W/m3 ，照射时间≥30 min。有人状态 下，采用循环风紫外线空气消毒器或静电吸附式空气消毒器，遵循产品使用说明。
仪器表面、内壁 用 70％酒精擦拭（适用时）。
/ 玻璃器材 玻璃器材用含有效氯 1000 mg/L 的含氯消毒剂或 70％酒精浸泡后清水冲洗，过 3 遍蒸馏水，干燥后包装高压。
高压蒸汽灭菌：121 ℃ 15 min～30 min。
配制的培养基 / 大部分培养基经 121 ℃ 15 min 高压蒸汽 灭菌，含葡萄糖培养基 115 ℃ 15 min；XLD 培养基经煮沸 10 min；SS 培养基煮沸 1 min～2 min；
显色培养基 100 ℃ 15 min。
检测后标本 / 高压蒸汽灭菌 121 ℃ 20 min。
培养物 / 高压蒸汽灭菌 121 ℃ 20 min。
3 5 标本处理及制片技术要求 5.1 标本处理的技术要求 微生物实验室根据标本类型、性状以及目标微生物种类进行标本处理的技术要求见表2。
表2 微生物标本处理的技术要求 标本处理 技术要求 离心 对肉眼所见清亮的体液标本，使用普通离心机离心后取沉淀进行接种及涂片；对脑脊液涂片标本宜使 用细胞离心机（1500 g～2500 g,15 min）进行甩片离心；进行结核分枝杆菌培养的脑脊液标本量建议至少在5 mL以上。
剪切 进行毛霉目真菌培养的标本，用无菌剪刀或手术刀片将组织剪成碎条状、块状或团状。
研磨 对块状组织标本，用无菌组织研磨器或研钵和杵，加入适量的生理盐水或营养肉汤进行研磨。研磨后 的组织浆液用于接种及涂片。
去污染 对可能存在目标菌之外的污染菌的标本，进行去污染处理。如从痰标本中分离军团菌可采用KCL-HCL缓冲液 (pH2.2)对痰标本进行1:10稀释，室温放置4 min后进行接种；分离厌氧菌（如产气荚膜梭菌或艰难梭菌），可采用与标本等量的无水（或95％）乙醇混合标本，室温（25 ℃）放置1 h，或采用80 ℃加热10 min后，接种至厌氧培养基。
液化 对黏稠痰，用消化液分散黏液成份。如对痰标本中的结核分枝杆菌，可采用N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC） 及2％～4％ NaOH，作用一定时间后进行涂片及接种。
5.2 制片的技术要求 5.2.1 制片的种类与技术要求 制片宜在生物安全柜内进行并尽可能使其自然干燥，不建议加热干燥，若采用烤片机，温度宜控制在60 ℃以下。用于检查分枝杆菌的涂片必须在Ⅱ级生物安全柜内进行。制片的种类与技术要求见表3。
表3 制片的种类与技术要求 种类 技术要求 涂片 用拭子或接种环取干酪样、脓性或血性痰均匀涂抹于玻片上；或用滴管吸取穿刺液、脓液滴到载玻片中央，使其均匀涂抹开；也可将采取了标本的拭子在玻片上轻柔滚动；也可用接种环取菌落在滴有生理盐水的载玻片上研磨。制备涂片要注意：1）避免标本因留置时间过长导致杂菌过多或致病菌溶解；2）避免采用陈旧培养物影响革兰染色的染色性；3）所形成涂膜的大小通常1 cm×2 cm，厚度以透过涂膜能辨认报纸上的文字 为宜。
悬滴 显微镜检查有鞭毛的细菌时，可采用滴管吸取粪便标本直接滴到载玻片上；或将在碱性蛋白胨水增菌培养后 的培养物滴到载玻片上。
粘片 对丝状真菌菌落，采用胶带粘性面粘取真菌菌落，然后将胶带置于已滴加乳酸酚棉蓝染液的载玻片上，用以 保持真菌特征性结构的原始位置。
压片 对浓稠或颗粒状标本，要先将其放到载玻片上，再用另一张载玻片放其上，两张载玻片对压后分开，两张载 玻片接触标本的一面均可作为压片标本。
印片 大块组织标本要先用无菌刀片切（或用无菌剪刀剪）成小组织块，再用镊子取组织放到玻片上，稍加用力使组织在载玻片上形成印迹，去掉组织块。
5.2.2 固定 为了使标本贴紧载玻片，需进行固定，防止染色过程中脱落。可采用加热固定或使用甲醇固定。加热固定时，载玻片要迅速通过酒精灯的外焰，来回3次；利用电热灭菌器固定时，不要将载玻片紧贴电 4 热灭菌器，时间不宜超过10 s；采用甲醇固定时，将无水甲醇覆盖在已加有标本的载玻片上，待其挥发干后即可使用。
6 染色技术要求 微生物实验室常用的染色方法、技术要求及质量控制见表4。
表4 常用微生物染色方法、技术要求及质量控制注 染色方法 技术要求 质量控制 革兰染色 1） 染色与脱色时间不宜过长或过短，以免影响染色结果；
2） 不推荐对鼻拭子、咽拭子等拭子标本及血标本直接进行涂片染色，导管不宜涂片染色。
金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）或已知革 兰阳性菌染成紫蓝色，大肠埃希菌（ATCC 25922）或已知革兰阴性菌染成粉红色。
抗酸染色 1）采用石炭酸复红染色时，推荐加热染色，时间为 5 min；
如采取不加热染色，时间宜不低于 15 min；
2）血液及导管不宜进行抗酸染色。
龟分枝杆菌（ATCC 93326）或已灭活分枝杆菌或已知抗酸杆菌染成红色。
弱抗酸染色 采用“1％～2％硫酸水溶液脱色 1 min～2 min 代替抗酸染色中的“3％盐酸酒精脱色 2 min”。
诺卡菌或马红球菌属或戈登菌属或冢村 菌属标准菌株（或质控菌株或已知弱抗酸染色细菌）染成红色。
荧光染色 金胺(O)染 色 1） 使用金胺（O）染色的时间为 15 min；
2） 在暗室中镜检。
分枝杆菌标准菌株（或质控菌株或已知分 枝杆菌）呈橙黄色荧光。
真菌荧光染色 真菌荧光染色的时间一般数秒即可，但对于指甲等厚硬组 织及黏稠标本，需先经 10 ％ ～30 ％ KOH 消化，再加入荧光染色液，可适当延长染色时间。
黑曲霉菌孢子和菌丝呈蓝绿色荧光（视荧光染液不同而不同）。
墨汁染色 1） 墨汁与脑脊液标本的比例以 1:1 或 1:2 为宜；
2） 加盖玻片应轻放以防止气泡产生，影响观察。
新型隐球菌具有厚荚膜，并可见芽生细 胞。
六胺银染色 1）玻片处理：甲醇固定后，自然风干，1 ％ 过碘酸滴染 10 min，流水冲洗；
2）银染 1 h～1.5 h，通常念珠菌染色 1 h 即可，疑为曲霉菌或其他丝状真菌须适当延长染色时间（银染试剂现用 现配，只用一次）。
根据 ATCC 90028 白念珠菌着色（棕黑色）的深浅调整染色时间。
乳酸酚棉蓝染色 1） 待检物在乳酸酚棉蓝染液中应静置 5 min，以使真菌菌丝及孢子着色；
2） 对于透明菌丝的丝状真菌，采用 75 ％ 酒精进行适当稀释可以更清晰看到产孢结构和孢子排列方式。
黑曲霉菌具有孢子和菌丝的形态，染成蓝色。
注：使用商品化染液应遵循产品说明书。
7 显微镜检查技术要求 7.1 普通光学显微镜检查的技术要求 7.1.1 革兰染色标本的镜检要求 在进行革兰染色标本观察时，需要注意：
a) 在油镜下观察菌体形态、排列、染色性，以及细菌是否在白细胞内或白细胞周围；
b) 将血液及脑脊液培养阳性标本革兰染色镜检结果作为危急值报告；对于痰及气管抽吸物标本宜根据低倍镜下鳞状上皮细胞数量及白细胞数量判断是否合格；未离心尿液中，若每个油镜视野看到1个细菌，相当于尿液细菌计数105 /mL；生殖道标本若见到革兰阴性双球菌，宜报告其是否位于中性粒细胞内；
c) 若在低倍镜下发现真菌菌丝或孢子，应转换至高倍镜或油镜确认。
5 7.1.2 抗酸及弱抗酸染色标本的镜检要求 在观察抗酸染色及弱抗酸染色标本时，需要做到：
a) 观察抗酸染色标本时，要将玻片按一定方向及顺序移动，做到不漏检、不重复。连续观察300个油镜视野未发现抗酸杆菌，方可报告抗酸染色阴性；
b）观察弱...