北京、山东和湖南地区烟粉虱抗药性及CYP4v2和CYP6CX1mRNA水平表达量分析

摘要于2011年采集北京、山东和湖南三地的烟粉虱，进行B、Q隐种鉴定，并测定4种杀虫剂的抗药性，同时通过荧光定量PCR分析CYP4v2和CYP6CX1两个基因的mRNA水平的表达量。结果表明，北京、湖南和长沙烟粉虱均为Q隐种。抗药性监测表明，北京和湖南种群对阿维菌素敏感，山东种群抗性水平较低，而对烟碱类药剂噻虫嗪出现不同程度的抗药性，其中湖南地区烟粉虱对噻虫嗪的抗药性达到49.08倍的高抗水平， 北京和山东地区也达到中抗水平。另外，这3个地区的种群对毒死蜱和联苯菊酯抗性水平都较低。通过qRTPCR分析三地的CYP4v2和CYP6CX1基因表达量，发现相对于敏感种群CYP4v2基因在北京、山东和湖南3个地理种群中分别过量表达3.85倍、19.57倍和10.78倍，而CYP6CX1基因在北京种群中过量表达20.55倍。结果提示田间烟粉虱的细胞色素P450基因CYP4v2和CYP6CX1过量表达可能会是烟粉虱抗药性的形成机制之一。

关键词烟粉虱；杀虫剂抗药性；细胞色素P450；荧光定量PCR

中图分类号：S 436.3文献标识码：A

烟粉虱属半翅目，粉虱科，小粉虱属，是危害极为广泛的世界性害虫之一。烟粉虱属于刺吸式昆虫，取食寄主植物的汁液，通过直接刺吸为害、传播植物病毒、引起植物生理紊乱、分泌蜜露诱发真菌病害给作物生产造成巨大的经济损失。烟粉虱于1889年首先发现于希腊烟草上，分布于世界100多个国家，由于地理差异和寄主广泛等原因逐渐形成多个复合种，目前报道的至少有32个隐种，不同隐种的烟粉虱在寄主范围、传毒能力、共生菌组成以及抗药性等方面都存在显著差异，在所有隐种中，B隐种和Q隐种烟粉虱入侵性最强，世界范围内分布最为广泛。烟粉虱在我国最早报道于1949年，暴发于20世纪90年代，当时B隐种烟粉虱主要存在于广东、山东、河北、天津和北京等地，给农业、园艺及观赏作物产业造成了严重的经济损失。2003年之前在我国发生为害的主要是B隐种烟粉虱，随后在河北、北京等地田间发现Q隐种烟粉虱，并且在2007年发现Q隐种烟粉虱逐渐取代B隐种烟粉虱成为主要为害种群。

在害虫的防治措施中，化学防治占居重要地位，为延缓和阻止众多严重为害经济作物的害虫暴发做出了重要贡献。但是由于常年、广泛使用杀虫剂，导致很多地区害虫对一些种类的杀虫剂产生不同程度的抗药性，并且在全国监测发现Q隐种烟粉虱对于一些杀虫剂的抗性要高于B隐种烟粉虱，连年施用后抗药性也逐渐增强，所以连续的、适时的抗药性监测是烟粉虱综合防治的前提和基础。

烟粉虱的抗药性产生机制是多方面的。现在关于烟粉虱的抗药性研究主要集中在解毒酶上，Karunker和Roditakis 研究发现细胞色素解毒酶P450家族的基因在B隐种和Q隐种烟粉虱的吡虫啉抗性中发挥重要的作用。Xie等通过B隐种烟粉虱噻虫嗪抗性和敏感品系的转录组研究，发现CYP4v2基因在抗性品系中过量表达，同时Zhuang等发现CYP6CX1的过量表达在烟粉虱对吡虫啉抗性中也产生一定贡献。

本研究对北京、山东和湖南三地的烟粉虱B、Q隐种类型进行了鉴定，同时测定了其对5种常用杀虫剂的抗药性，并且通过荧光定量PCR检测了CYP4v2和CYP6CX1基因在3个不同地区田间种群的mRNA水平表达情况，从而为解释田间抗药性形成机制和指导当地烟粉虱的化学防治提供科学依据。

1材料与方法

1.1烟粉虱试虫

2011年秋季，分别从北京海淀区中国农业科学院蔬菜花卉所实验基地，山东济阳茄子田和湖南长沙农科院黄瓜大棚采集烟粉虱成虫。敏感种群为中国农业科学院蔬菜花卉研究所室内饲养种群，该种群于2000年采自试验基地的甘蓝寄主上，实验室以甘蓝饲养至今，从未接触过任何杀虫药剂。田间采集的烟粉虱分别取300头活体成虫，液氮速冻5 min，然后保存于-80 ℃冰箱用于荧光定量PCR检测。

1.2供试杀虫剂

25%噻虫嗪水分散粒剂（瑞士先正达作物保护有限公司产品）、1.8%阿维菌素乳油（北京中农大生物技术股份有限公司产品）、10%联苯菊酯乳油（苏州富美实植物保护剂有限公司产品）和48%毒死蜱乳油（美国陶氏益农公司产品）。

1.3主要试剂

昆虫基因组DNA提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司；Taq酶，cDNA合成试剂盒（PrimeScriptRT reagent Kit）购自北京六合通经贸有限公司（TaKaRa Biotech）；TRIzol，荧光定量试剂盒（SYBRGreen Realtime PCR Master Mix）购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.4B、Q隐种鉴定

烟粉虱成虫B、Q隐种鉴定参照潘慧鹏的方法进行。检测每个种群选取10头，单头提取DNA，依据B和Q隐种烟粉虱mtCOI基因序列片段长度差异使用特异性引物进行鉴别，其中Q隐种烟粉虱的特异性片段为478 bp，而B隐种烟粉虱为303 bp。

1.5抗药性监测

烟粉虱成虫对杀虫剂的生物测定方法采用浸叶法，具体操作参照Feng。每种供试药剂配制6个浓度及1组空白对照，每个浓度4次重复，药剂配制加入0.1‰曲拉通X100。在指形管底部铺上2%的琼脂约2 mL（管壁无水汽），将预先用打孔器打好的甘蓝叶片浸药10 s，晾干后背面朝上轻放于琼脂上。每管接入20～30头烟粉虱，用棉塞封口。指形管倒置于（25±1）℃，L∥D=14 h∥10 h的光照培养箱内，48 h后检查各处理的死亡数和存活数。

1.6RNA提取和cDNA合成

每个样品取烟粉虱100头，采用TRIzol法提取总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，以及Nanodrop2000检测RNA浓度。取1.0 μg RNA利用PrimeScriptRT reagent Kit合成cDNA ，方法按照产品说明书进行 （除去了基因组DNA）。

1.7荧光定量PCR

荧光定量PCR引物参照Zhuang进行（见表1），具体操作参照天根的荧光定量试剂盒说明书，稀释2倍的反转录产物作为模板，利用ABI7500进行基因mRNA水平表达量分析。荧光定量PCR反应体系：SYBR Green Realtime PCR Master Mix （2×）11.25 μL，PCR Forward Primer （10 μmol/L） 0.5 μL，PCR Reverse Primer （10 μmol/L） 0.5 μL，cDNA 模板 1.0 μL，加入 ddH2O 补足到 25 μL。RealTime PCR 反应程序为：95 ℃预变性 3 min，接下来是 40 个循环，95 ℃变性 30 s，61 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s （收集荧光信号）；每个样品 3 次重复，PCR反应结束后进行相关数据分析。