铁皮石斛RCA2基因克隆与生物信息学分析

摘要： 核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶是光合碳同化作用的关键酶，它对调节铁皮石斛Rubisco活性和光合速率具有直接的作用，对其进行基因等方面的研究，会对改变植物光合速率打下良好基础。该研究以一年生铁皮石斛叶片为材料，采用 RTPCR和 RACE技术成功克隆了Rubisco活化酶（RCA）基因，并对其进行生物信息学分析。结果表明：RCA基因全长1 730 bp，命名为RCA2（GenBank登录号KT205842），其中5′UTR 81 bp 、3′UTR 326 bp，开放阅读框1 323 bp，编码440个氨基酸，分子质量为48.53 kDa，等电点为6.19，包含Ploop NTPase 超家族基因结构。氨基酸多重序列比对发现RCA2核苷酸序列与蝴蝶兰的相似性高达87%。RCA2编码蛋白为亲水性蛋白；亚细胞定位于叶绿体基质；蛋白质二级结构分析，α螺旋占30.68%，延伸链占25.45%，不规则折叠占43.86%。RCA2编码蛋白质的功能预测发现，RCA2在中间代谢起到了一个非常重要的角色。该研究发现对铁皮石斛光合作用关键酶Rubisco 的分析可为其光合作用特性的发掘提供理论基础，并为提高温室大棚栽培效率提供理论依据。

关键词： 铁皮石斛， RCA2基因， 克隆， 生物信息学分析

中图分类号： Q949.71

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）01008007

Abstract： Ribulose1，5bisphosphosphate carboxylase/oxygenase was a key enzyme of photosynthetic carbon assimilation， it had direct adjustive effects Rubisco activity and photosynthetic rate of in Dendrobium officinale， and laid a good foundation for changing plant photosynthetic rate by studying the gene. RCA gene was cloned from leaf of annual D. officinale using RTPCR and RACE， and was analyzed by bioinformatics. The results showed that the full length cDNA of RCA was 1 730 bp length， the cloned RCA gene was named RCA2（GenBank accession No. KT 205842）. It was contained a 5′untranslated region （5′UTR） （81 bp）， 3′UTR （326 bp），and an opening reading frame （ORF） （1 323 bp）， which could be translated into a 410aminoacid putative peptides with a molecular weight of 48.53 kDa and a theoretical pI of 6.19， with a domain of Ploop_NTPase superfamily. Multiple sequence alignment results showed that the homology of nucleotide sequence between the RCA2 and the reported Phalaenopsis genes was 87%. RCA2 protein was belong to hydrophilic protein，subcellular localization was in the chloroplast. The RCA2 protein secondary structure components showed that ahelix（h）， extended strand（e）， and random coil （c） accounted for 30.68%， 25.45% and 43.86%. RCA2 encoding protein function prediction showed that RCA2 played a very important role in intermediary metabolism. This study of the key enzymephotosynthesis Rubisco in Dendrobium officinale provides the information for the research of the photosynthetic characteristics， and the basis for improving the efficiency of greenhouse cultivation.

Key words： Dendrobium officinale， RCA2 gene， gene cloning， bioinformatics analysis

铁皮石斛（Dendrobium officinale）属于兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生的草本植物，铁皮石斛含石斛多糖、石斛碱、双苄酚类、菲酚类等多种药效成分，是石斛属药用植物中最为珍稀名贵的种，具有滋阴清热、润肺止咳、益胃生津、明目强身等作用（Zhang et al，2000）。核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose1，5bisphosphate carboxylase /oxygenase，Rubisco）是存在于叶绿体内的一个双功能酶，同时催化卡尔文循环中最初固定CO2的反应以及光呼吸作用中的第一步反应，该酶处于光合碳还原和碳氧化两个方向相反但又相互关联的循环交叉点上，对净光合速率起着決定性的影响，因此提高Rubisco 活力是提高光合作用的重要途径（潘瑞炽等，2004）。因铁皮石斛原生地的生境破坏和常年的滥采乱挖，野生资源遭到严重的破坏，濒临灭绝，已列入中国珍稀濒危保护植物的名录。由于石斛不能够栽培在土壤里，北方地区必须栽培在树皮、木块、锯末等做的栽培床或者是石头上，冬天多数需要盖温棚等设施，投资较大，加上石斛种植的技术要求高， 目前市场尚未完全打开，发展速度还不是很快（张明等，2010）。

随着生物技术的发展，许多粮食作物如大麦（Rundle & Zielinski，1991）、水稻（To et al，1999）、大豆（Yin et al，2014）等植物的RCA基因被克隆，但目前报道的RCA基因很少有涉及药用观赏植物，最近有朱明库等（2013）对羽衣甘蓝Rubisco 活化酶基因BoRCA的克隆、生物信息学及表达分析的研究；袁秀云等（2016）对蝴蝶兰Rubisco活化酶基因PhRCAα的序列特征及在低温胁迫下的表达分析的研究；祝钦泷等（2011）对彩叶草Rubisco活化酶基因SsRCA进行了组织表达特异性和光诱导表达特性研究；曾淑华等（2012）已从铁皮石斛中克隆了光合碳途径关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。因此，开展铁皮石斛RCA基因研究显得尤为必要。本研究为了提高石斛的质量，提高石斛光合效率，揭示铁皮石斛光合作用机理自然成了铁皮石斛研究领域的重要问题，该研究利用RACE技术克隆出铁皮石斛RCA2全长基因，并进行生物信息学分析，为进一步研究铁皮石斛光合作用调节机理奠定基础。

1材料与方法

1.1 材料

铁皮石斛原产地为贵州，现在种植于河南省郑州市郑州师范学院兰花工程技术研究中心智能日光温室，植物材料为一年生铁皮石斛。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取选取一年生铁皮石斛叶片，液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱备用。叶片总RNA提取采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（Tiangen公司）；采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性；采用 Quawell Q5000 微量紫外可见分光光度计测定其A260/A280值及其浓度。

1.2.2 RCA2基因全长的克隆以提取的叶片总RNA为模板，用反转录试剂盒合成单链cDNA。根据GENBANK上已知植物的RCA保守区，利用DNAMAN和Primer 5.0生物軟件设计兼并引物（表1），扩增RCA保守片段。PCR反应体系为20.0 μL：10×PCR buffer 2.0 μL、dNTP Mix 2.0 μL、上游引物 RCAF1（10 μmol·L1） 1.0 μL、下游引物RCAR1（10 μmol·L1）1.0 μL、模板cDNA 1.0 μL、rTaq酶 （5 U·μL1 ） 0.2 μL，加灭菌双蒸水至总体积 20.0 μL；反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。切胶回收目的片段，连接pGEMT Easy载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆送至上海英潍捷基生物技术公司测序，获得RCA基因的保守区序列。再根据获得的保守区序列，分别设计5′端和3′ 端特异性巢式引物（表1），以叶cDNA 为模板，用巢式PCR 方式分别扩增RCA的5′ 端和3′ 端序列，按 Clontech 公司 SMARTerTM RACE 扩增试剂盒操作说明进行反应，回收扩增目的产物，克隆到pGEMT Easy载体上，转入大肠杆菌 DH5α菌株，进行测序和拼接。

1.2.3 ORF的扩增根据 DNAMAN软件拼接得到RCA基因序列全长，利用Premier 5.0设计1对特异引物 RCAF2和 RCAR2（表1），用于完整开放阅读框（ORF）的扩增。PCR扩增程序为94℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min，进行35个循环，72 ℃延伸15 min。ORF片段连接到pGEMT Easy载体上，转化大肠杆菌DH5α，测序进行ORF 序列验证。

1.2.4 生物信息学分析利用ORFfinder进行开放阅读框的预测；利用NCBI上的BLAST进行基因相似性的分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）；利用DNAMAN进行氨基酸序列比对分析；利用ProtScale程序（http：// expasy.org/tools/protscale.html）分析蛋白质亲疏水性；利用TargetP软件（Using PLANT networks）和PSORT ll（http：//psort.hgc.jp/form.html）进行亚细胞定位的分析；利用Protfun（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）分析预测RCA2蛋白质结构功能和功能分类；利用ExPASy网站上的GOR进行蛋白质二级结构预测；利用ExPASy网站上的SWISSMODEL 进行蛋白质三级结构的预测分析。

2结果与分析

2.1 RCA2基因全长克隆

叶片总RNA提取后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，检测结果显示，28S和18S条带清晰，A260/A280值1.96，浓度为210.56 ng·μL1。

以铁皮石斛叶片总RNA反转录的cDNA为模板，以兼并引物RCAF1和RCAR2进行保守区片段PCR扩增，得到一个503 bp保守片段（图1：B），根据设计的3′ 端和5′ 端特异引物，采用RACE技术，扩增获得3′端目的片段（图1：D）和5′ 端目的片段（图1：C）。利用生物软件DNAMAN进行序列拼接得到该基因的全长为1 730 bp，利用ORFfinder分析，共有9个ORF，该基因最长的ORF共计1 323 bp， 包含81 bp 的5′UTR、326 bp 的3′UTR，编码440个氨基酸，将该基因命名为RCA2，GenBank登陆号为KT205842。利用引物RCAF2和RCAR2扩增获得1 323 bp ORF片段（图1：A），连接到pGEMT Easy载体上测序验证，得到的阳性质粒命名为pGEMRCA2。

2.2 RCA2基因全长的生物信息学分析

2.2.1 RCA2核苷酸及编码蛋白序列的理化性质利用blastp 和DNAMAN对RCA2氨基酸序列进行比对分析，发现该基因包含Ploop NTPase Superfamily结构域，分别为“WGGKGQGKS”（A区）和“GKMCCLFINDLD”（B区），属于Ploop NTPase 超家族基因（图2）。理化性质分析该蛋白的分子质量为48.53 kDa，等电点为6.19。将该基因全长核苷酸序列在NCBI上进行blastn相似性比较，结果表明基因均为RCA基因，且与蝴蝶兰（Phalaenopsis）的相似性高达87%。氨基酸序列比对分析，发现其氨基酸序列与蝴蝶兰、葡萄、荷花的相似性分别为89%、84%、85%（图3）。

2.2.2 RCA2编码蛋白质的亲疏水性分析利用ProtScale分析蛋白的亲疏水性发现， RCA2蛋白质序列具有较高的亲水性，其中第69位的Thr亲水性最强（-3.078），第162位Leu的疏水性最强（2.122）（图4）。

2.2.3 RCA2编码蛋白质的亚细胞定位蛋白的亚细胞定位与该蛋白所执行的功能是密切相关的， 用TargetP和PSORT II软件进行亚细胞定位分析，TargetP预测结果显示RCA2蛋白定位于叶绿体基质，可信度为3（图5：A），用PSORT II预测蛋白显示，RCA2蛋白定位于叶绿体基质、线粒体基质间隙、叶绿体类囊体膜、叶绿体类囊体腔，RCA2蛋白主要存在于叶绿体基质（图5：B）。

2.2.4 RCA2编码蛋白质的功能预测与分析利用Protfun software of CBS 分析预测RCA2蛋白质结构功能和功能分类，可能有意义的功能包括中间代谢、脂肪酸代谢、翻译、辅酶因子的生物合成和能量代谢等，他们的几率分别是5.484、4.387、4.048、3.639、3.098。这表明RCA2在中间代谢起到了一个非常重要的角色，在脂肪酸代谢、翻译中起到了重要作用，在辅酶因子的生物合成和能量代谢中也起到了关键作用。

2.2.5 RCA2编码蛋白质的二级、三级结构预测采用ExPASy网站上的GOR进行蛋白质二级结构预测，结果表明，α螺旋占30.68%，延伸链占25.45%，不规则折叠占43.86%（图6）。用ExPASy网站上的SWISSMODEL Workspace预测蛋白质的三维结构以4w5w.1.A（SMTL id）为模板进行建模，该模板以XRAY 2.90 方法产生，与RCA2蛋白一致性为86.02%（图7）。

3讨论与结论

该研究通过RTPCR和RACE技术方法，成功克隆了铁皮石斛RCA2基因（GenBank登录号KT205842）全长1 730 bp，开放阅读框1 323 bp，编码440个氨基酸；核苷酸序列分析结果表明，RCA2核苷酸序列与蝴蝶兰（Phalaenopsis）的相似性高达87%，其编码蛋白属于Ploop NTPase Superfamily家族基因。蛋白理化性质分析该蛋白的分子质量为48.53 kDa，等电点为6.19，为亲水性蛋白，RCA2编码蛋白质的亚细胞定位于叶绿体基质；编码蛋白质的功能包括中间代谢、脂肪酸代谢、翻译、辅酶因子的生物合成和能量代谢等，蛋白质三级结构预测模型与RCA2蛋白一致性为86.02%，这些生物学参数为进一步研究RCA2蛋白的酶学性质及其在铁皮石斛中的光合作用机理奠定了理论基础。

Rubisco作为光合速率的限制性因子，近些年已成为提高植物光合效率的研究目标之一，而 RCA对维持 Rubisco 的净光合速率及初始羧化活力均有重要调节作用（张国等，2005） RCA自被Salvucci et al（2005）在拟南芥中报道以来，一直是农业生物工程研究关注的焦点。当RCA基因表达量降低时，植物的光合速率随之下降，生长也变慢， 因此通过调控RCA的表达提高光合作用，最终实现植株产量的增加，将会有广泛及良好的前景（李海霞等， 2010）。Rubisco活化酶能维持并调节植物Rubisco 的活性，使 Rubisco 的活性位点因为与磷酸糖类物质的结合而导致活性降低的不利影响得到最大程度的抑制，且能够降低 Rubisco 去氨基甲酰化时所需CO2的浓度，显著提高Rubisco 的活性，因此对调节植物光合速率有着直接作用 （Portis， 2003；Salvucci & CraftsBrandner， 2004； Zhang et al， 2002）。铁皮石斛是药用观赏植物，其RCA基因的分子克隆、生物信息学的研究，为研究其他药用观赏植物RCA基因的结构及功能提供了参考和借鉴价值，并为进一步研究 Rubisco 活化酶在铁皮石斛光合作用中的功能和分子调控机理奠定了基础，其进一步的相关研究工作正在進行中。

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