不同品种小麦成熟胚愈伤组织的诱导与分化

材料与方法

1.1 序列数据

从UniProt数据库（http：///meme/cgi-bin/meme.cgi）对所有氨基酸序列和结构域分别进行功能域预测。

2 结果与分析

2.1 DMATS基因家族序列

经过对数据库的检索和利用BioEdit v7.1分析，总共得到37种微生物中的77条DMATS序列，主要来自真菌类生物，少部分来自细菌。其中，Neosartorya fumigata中报道的个数最多，多达7个，其他菌种报道的个数依次为：Aspergillus flavus中包含6个，Ajellomyces capsulata、Arthroderma otae 中各包含5个，Arthroderma gypseum、Trichophyton equinum 中各包含4个，Ajellomyces dermatitidis、Claviceps purpurea、Metarhizium robertsii、Trichophyton rubrum中各包含3个，Claviceps fusiformis、Colletotrichum higginsianum、Epichloe festucae、Magnaporthe oryzae、Neosartorya fischeri、Neotyphodium coenophialum、Trichophyton tonsurans中各包含2个，其他各包含1个（表1）。

2.2 部分DMATS序列之间的多重比对

对部分DMATS序列进行同源性分析（图1），结果表明这10种已知的产生物碱的DMATS具有较高的同源性。但也有部分区段的变异，这可能是该基因的进化区段，这些区段的信息可能为基因进化理论的研究提供一些参考依据。

2.3 DMATS系统进化树分析

对搜索到的37种微生物中的77条DMATS蛋白质序列使用Clustal W软件进行多重比对，再由MEGA v4.0软件得到这些同源序列的系统进化树（图2）。系统进化树揭示了这些物种DMATS的进化关系。由图2可知，DMATS广泛存在于真菌和细菌之中。这些同源序列主要分为两大簇，在第一簇中所有物种均为真菌，其中有按照物种来源的进化关系聚类[如Aspergillus flavus（H6UZI7和H6UZJ0） 等]，但也有几种真菌DMATS并未完全按照物种来源聚类[如Neosartorya fumigata（B0X

W14和B0XWK7）等]，表明它们在进化中存在独立的复制，说明在物种的分化之前DMATS已经存在。在第二簇中既有真菌也有细菌，Saccharomonospora azurea（H8G878）、Saccharomonospora cyanea （H5XN

99）和Saccharomonospora xinjiangensis（I0V343）的关系较近，可能因为它们同属于细菌，而它们与Metarhizium robertsii（E9FDH2）的关系最远，并且Metarhizium robertsii（E9FDH2）、Streptomyces sp. （D6

RT90） 各在一个分枝上，说明细菌和真菌在进化的速度上不同或它们在进化过程中发生了独立的复制事件。

2.4 DMATS跨膜螺旋结构、信号肽预测的分析

跨膜结构域是膜内蛋白质与膜结合的区域，一般由20个左右的疏水氨基酸残基组成，形成α螺旋，它固着于细胞膜上起锚定作用。蛋白质序列含有跨膜区提示它可能作为膜受体起作用，也可能是定位于膜的锚定蛋白质或者离子通道蛋白质等。因而，含有跨膜区的蛋白质往往和细胞的功能状态有密切关系。对DMATS基因家族各物种的跨膜螺旋结构分析可知，DMATS均不含有跨膜结构，且显示游离在膜外发挥功能，这种不确定的定位可能与其家族成员功能的分化有关。

信号肽位于蛋白质的N端，是一段引导合成的肽链进入细胞器的识别序列，一般由16～26个氨基酸残基组成，蛋白质在细胞质中的核糖体上合成后，在信号肽的引导下，转运至不同的细胞器或细胞质基质的特定部位发挥作用。通过对DMATS基因家族的各成员的信号肽分析发现，大部分DMATS蛋白质不含有信号肽结构，但是Ajellomyces capsulata（C6HC16）却含有信号肽结构（图3），由此可以判断Ajellomyces capsulata（C6HC16）可能是分泌蛋白质或者与分泌蛋白质类似。由此推断，大多数不含有信号肽的DMATS在核糖体中翻译后，可能通过膜定位信号被转运到作用位点；而含有信号肽的DMATS在翻译后，可能通过内质网被转运至作用位点。表明DMATS可能具有不同的合成转运机制。

2.5 DMATS蛋白质motif预测的分析

功能域是指蛋白质分子中的一些二级结构单元，往往有规则地聚集在一起形成全由α-螺旋、β-折叠或α-螺旋与β-折叠混合、均有的超二级结构基本形式，具体说，形成相对稳定的αα、βββ、βαβ、β2α和αTα等超二级结构，又称模体或模序。通过使用MEME v4.9在线分析软件分别对DMATS进行分析，结果显示共得到了20个预测的motifs（图4）。从图4可以看出，不同来源的DAMTS基因家族含有的motif的数量和类型是有差异的。由此推断，motif的多样性可能与不同物种参与体内细胞的多样代谢途径和各种不同的反应有关。同时，对DMATS的结构域 （Trp_DMATS） 进行MEME在线分析发现，有7个预测的motifs具有较好的保守性（表2），其中最长的motif长度为21个氨基酸残基，最短的为8个氨基酸残基，初步分析，motif 6最为保守。

3 讨论

本研究利用生物信息学方法在UniProt数据库中最终确定了37种微生物中的77条DMATS蛋白质序列，其中大部分来自真菌，少部分来自细菌。其中一些微生物产碱能力的研究未见报道，这可能是因为人们对产生少量生物碱的物种没有给予过多的关注。但是，目前国内外已证实麦角菌、半数以上的香柱菌、青霉菌、曲霉、内生真菌等都有产生物碱的能力[6，14，15]。

系统进化树显示，第一簇中是真菌的聚类，第二簇中是真菌和细菌的聚类。第二簇中的3种细菌均属于单孢菌属。关于糖单孢菌属是否具有产麦角碱的能力的研究报道，笔者暂时没有检索到相关的文章，这可能与笔者的检索能力和检索方法有关。不过，笔者更倾向于经典的阐述，当一个基因发生复制后，各拷贝的命运有两种可能：大多数情况下其中一个拷贝仍然保持有产麦角碱的功能，受到负选择作用而趋于稳定，其余的拷贝则不受选择作用而逐渐假基因化[16]。另外一种相当少见的情况是，当群体处于新环境时，受到的选择条件产生了变化，需要新的基因功能，而基因复制被认为是基因功能进化的主要动力[17]。因此，笔者推断，在糖单孢菌属中编码DMATS的基因可能是假基因，不具有产麦角碱的作用，而具有其他未知的功能。

通过使用MEME v4.9在线分析软件对DMATS的结构域进行预测，发现了7个保守性较好的motifs，初步分析，motif 6最为保守。同一物种含有不同类型的DMATS （如Claviceps fusiformis），表明同一物种的DMATS序列具有差异性，可能会产生不同的生物功能或者功能上的相互协调，通过共有的motif来完成保守的功能，同时不同的motif又可以使DMATS在不同的代谢环境中发挥不同的功能，或者在物种进化之前DMATS已经表现出了多样化。

Marsden等[18]和Auld[19]的研究表明，在蛋白质序列中天冬氨酸和谷氨酸被认为是结合金属离子的配体。分析这7条保守的motifs可知，天冬氨酸的出现频率比较高，因此推断，天冬氨酸可能是金属离子的结合位点。

目前已有学者利用传统的育种方法把醉马草成功地进行了脱毒[20]，使之成为“益草”，但尚未在分子水平上进行研究。本研究利用生物信息学方法对编码DMATS的基因进行分析并且找到了该基因家族的保守motif。希望以此为切入点，设计醉马草内生真菌编码DMATS基因的RNA干扰引物，从而使该基因的表达下调，进而在分子水平上控制醉马草内生真菌的产碱能力。

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