材料与方法
1.1 仪器与主要试剂
机械组织匀浆机（Polytron-ultraturrax公司，德国），显微镜图像分析仪（Motic image advance 3.0，香港）。即用型SABC免疫组化试剂盒兔IgG（SA1022），多克隆兔源抗兔MMP-2与VCAM-1抗体（博士德生物工程有限公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L），碧云天生物技术研究所。
1.2 动物
新西兰雄性大耳白兔40只，购自无锡市惠山江南实验动物场，许可证号：SCXK（苏）2002-0006。饲养温度20～25 ℃，湿度50%～70%，体质量1.5～1.7 kg，4～5月龄。SPF级条件每只单笼饲养于福建省中医学院动物实验室内，随机分成5组，每组8只。经1周动物室基础饲料的适应性喂养后进行实验。
1.3 药物
康欣胶囊，福州屏山制药厂生产，批号040801，每粒0.3 g；阿托伐他汀钙，辉瑞公司生产，国药准字J20030047，每片10 mg。
1.4 造模
采用内膜损伤加高胆固醇饮食法建立兔AS模型：3%戊巴比妥钠30 mg/kg经耳缘静脉注射麻醉，同时检查瞳孔反射，固定于手术板上，颈部脱毛消毒，颈部正中纵行切口，钝性分离，暴露左侧颈总动脉，分叉处分离长度约为2 cm，结扎颈外动脉，用动脉临时夹夹闭左侧颈总动脉近心端和远心端后，用手术小剪刀剪颈外动脉部分血管，用3F球囊导管插入颈外动脉，经颈外动脉进入左侧颈总动脉，扩张球囊至体积为0.2 mL，进入长度为7～8 cm，来回抽3次，结扎颈外动脉，松开动脉夹，恢复左侧颈总动脉血流，用生理盐水灌洗手术切口，并缝合皮肤，每日给予青霉素80万，连续3 d。手术后予高脂饲料（胆固醇2%，猪油5%，蛋黄粉10%，猪胆盐0.5%，基础饲料82.5%），每日每只150 g。喂养6周取材。
1.5 分组与给药
模型组：左侧颈总动脉手术，给予高脂饮食，自由饮水；阿托伐他汀钙组（他汀组）：左侧颈总动脉手术，给予高脂饮食，自由饮水，每日喂高脂饲料加阿托伐他汀钙2.5 mg/kg；康欣胶囊小剂量组（小剂量组）：左侧颈总动脉手术，给予高脂饮食，自由饮水，每日喂高脂饲料加康欣胶囊0.4 g/kg；康欣胶囊大剂量组（大剂量组）：左侧颈总动脉手术，给予高脂饮食，自由饮水，每日喂高脂饲料中加康欣胶囊1.6 g/kg；正常对照组：分离结扎左颈外动脉，不拉伤。给予普通饮食，自由饮水。每周称重1次，根据体质量调整用药量。喂养6周。在实验过程中，有3只兔因腹泻、麻醉意外等原因死亡，其中正常对照组、大剂量药物组及模型组各死亡1只。
1.6 组织处理
6周末，禁食12 h，空气栓塞处死，剪取颈总动脉。取材后用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，常规病理连续切片，切片厚度 4 µm，进行HE（伊红/苏木素法）染色及免疫组化分析。
1.7 病理形态学检查
常规脱水、石蜡包埋后切成4 µm的薄片，HE染色，用图像分析仪摄像求积法测定颈动脉血管壁（中膜）面积/血管腔面积之比（W/L）。
1.8 基质金属蛋白酶-2、血管细胞黏附分子-1蛋白表达
采用SABC免疫组化方法。切片经常规二甲苯两次脱蜡、梯度酒精水化后蒸馏水冲洗，以枸橼酸盐缓冲液为抗原修复液高压修复、冷却；3%H2O2室温封闭10 min，去除内源性酶。蒸馏水冲洗玻片3 min×3次；PBS冲洗玻片3 min×3次，滴加5%山羊血清避光封闭20 min。滴加MMP-2、VCAM-1（1∶100）一抗，4 ℃湿盒中过夜后，平衡至室温PBS冲洗玻片2 min×3次。滴加生物素化二抗，滴加试剂SABC，PBS冲洗5 min×4次；DAB显色。苏木素复染，逐级脱水、透明、封片。镜检MMP-2、VCAM-1的分布，阳性反应为细胞胞浆、胞膜或细胞外基质呈棕褐色。免疫组化切片进行计算机图像分析，采用Motic Images Advanced 3.0软件测算MMP-2与VCAM-1的光密度值（IOD）及阳性面积百分比。
1.9 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据均以—x±s表示，组间两两比较若方差齐时选择LSD法、方差不齐时选择Tamhane法进行方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 组织病理学变化
HE染色兔颈动脉切片，光学显微镜下（×100），正常对照组动脉管腔未见异常改变，可见内皮完整，中膜平滑肌及弹性纤维完整，外膜为疏松结绨组织。模型组动脉内皮下可见广泛的吞噬脂质的泡沫样细胞，与胶原纤维混合形成粥样斑块，中膜平滑肌及弹性纤维广泛断裂，血管管腔狭窄，管壁厚度不一，外膜充血。他汀组动脉病变不明显，在内膜下可见散在的泡沫细胞，管壁各部基本完整，外膜为纤维结缔组织，未见血管充血。小剂量组动脉内皮下仍可见较大量泡沫细胞沉着，大部区域可见较完整的平滑肌及弹性纤维，外膜小血管充血。大剂量组动脉管壁左侧可见一偏月型纤维斑块，管壁轻微狭窄，余未见病变。
2.2 各组血管腔壁变化（见表1）
3 讨论
目前对易损的、不稳定斑块的识别及预防方面尚无有效的方法和措施。因此研究稳定粥样斑块，预防斑块破裂，甚至阻止AS的发生、发展及消退AS斑块的治疗方法，具有重要的现实意义。如何使斑块稳定，减少心脑血管事件的发生已成为研究的热点。
在斑块的生长过程中，分泌大量胶原参与斑块的形成，由于MMPs可降解斑块内的基质成分从而导致斑块破裂，所以抑制斑块内的MMPs可稳定斑块[3]。MMP是一族锌离子依赖性内肽酶，它们分子大小各异，底物不尽相同。在正常成人的组织中通常是低水平表达，但在一些正常或病理性重建的过程中表达上调。依据其降解产物的不同可分为4类。MMP-2属于MMPs中明胶酶的一种，主要来源于中性白细胞和巨噬细胞。既往研究发现，在急性心肌梗死患者血清中MMP-2表达明显增加[4]。
细胞黏附分子是一大类细胞膜表面糖蛋白，其中免疫球蛋白超家族的VCAM-1可使循环中的细胞与激活的内皮细胞紧密结合，内皮损伤为促发炎症反应的始动环节。内皮细胞受损后，血管内表面由于表达了VCAM-1等黏附分子从而变“黏”，细胞黏附分子表达增多，介导血流中更多的白细胞在血管壁上滚动，牢固黏附继而穿越内皮细胞进入内膜[5]。单核细胞黏附于内皮细胞上的数量增多，趋化迁移至内膜下成为巨噬细胞，吞噬氧化修饰的LDL，转变为泡沫细胞参与形成粥样斑块[6]。浸润斑块的活化淋巴细胞分泌γ-干扰素，抑制斑块中平滑肌细胞的胶原基因的表达及胶原合成，并可抑制平滑肌细胞的增殖，促进其死亡与凋亡，削弱斑块的基质，使纤维帽变薄，导致斑块的不稳定。有前瞻性研究发现，VCAM-1是冠心病患者未来致命性心血管事件最强的独立预测因子[7]。
中医学虽无AS之称，但有类似病变及其临床表现的论述，与中医“脉痹”有一定的相似性。AS的发病与心、肾、脾及痰浊、血瘀有关。肾虚血瘀在AS病机中占有十分重要的位置。中医的肾虚是对下丘脑-垂体-靶腺轴、神经、内分泌、免疫、生化代谢等生理病理的概括。是以神经、内分泌紊乱为主的机体内环境综合调控机能障碍，这些障碍既可导致机体老化等动脉硬化的出现，也是血瘀的根源；肾虚可以促进血瘀的发生发展，血瘀又加重肾虚的病情，二者互相影响，互为因果。此外，脾胃虚弱、气血衰少，以及因虚夹痰夹瘀与老年病也有一定关系。
基于上述脏腑虚衰，肾虚为主，脾虚为次，以及气血衰少和虚中夹痰夹瘀是老年性疾病的主要原因，治宜补肾填精，兼顾健运脾气，配以益气养血，活血祛瘀。康欣胶囊由枸杞子、制何首乌、淫羊藿、女贞子、当归、菟丝子、黄芪、黄精（制）、丹参、山楂、菊花、地骨皮等组成。诸药配合，补中有通，标本兼治，共奏补益脾肾、养血活血之功。
本实验免疫组化染色结果显示：与正常组比较，模型组可见MMP-2广泛表达于粥样斑块泡沫样细胞中，呈棕黄色，颜色深，量多。他汀组除去血管上正常表达，可见MMP-2标记的小的纤维斑块，阳性物量少，颜色浅。康欣胶囊小剂量治疗后，在内膜下的纤维斑块泡沫细胞中可见MMP-2表达，量少，颜色仍较深。大剂量组基本表达如他汀组。光密度值及阳性面积百分比在模型组最高（P<0.05）。阿托伐他汀钙及康欣胶囊大、小剂量药物干预后上述指标均有所下降，大剂量组与他汀组比较差异无统计学意义，但与小剂量组比较差异有统计学意义（P<0.05）。在颈动脉斑块中VCAM-1免疫组化染色结果显示：模型组VCAM-1标记出因动脉管壁形成广泛的粥样斑块，管腔大为狭窄，阳性表达物量多，呈棕黄色，颜色深。他汀组VCAM-1标记出一小纤维斑，表达量少，颜色浅。小剂量组VCAM-1阳性表达物量少，颜色仍较深。大剂量组可见VCAM-1表达量少，颜色浅。光密度值及阳性面积百分比在模型组显著升高（P<0.05）。中西药物干预后上述指标均有所下降，大剂量组与他汀组比较差异无统计学意义，但与小剂量组比较差异有统计学意义（P<0.05）。
综上所述，推测康欣胶囊可通过抑制VCAM-1表达，减少白细胞的黏附作用，使AS的始动环节受到影响，减轻AS斑块纤维帽周围的炎症环境；通过选择性的改变粥样斑块中的MMP-2的表达，减少基质的分解破坏，减慢斑块的降解速度，加固斑块的纤维帽，可能是其稳定斑块的机制之一。
参考文献：
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[2] Honda O， Sugiyama S， Kugiyama K， et al. Echolucent carotid plaques predict future coronary events in patients with coronary artery disease[J]. J Am Coll Cardiol，2004，43（7）：1185-1187.
[3] Nanni S， Melandri G， Hanemaaijer R， et al. Matrix metallo- proteinases in premature coronary atherosclerosis：influence of inhibitors， inflammation， and genetic polymorphisms[J]. Transl Res，2007，149（3）：137-144.
[4] 李艳玲，孟晓萍，曲玲.基质金属蛋白酶-2在急性心肌梗死患者血清中的表达[J].中华急诊医学杂志，2003，12（4）：231-233.
[5] Jaakkola k， Jalkanen S， Kaunis MK， et al. Vascular adhesion protein-1， intercellular adhesion molecule-l and P-selectin mediate leukocyte binding to ischemic heart in humans[J]. Am Coll Cardiol，2003，36（1）：122-129.
[6] Plutzky J. Inflammtory pathways in atherosclerosis and acute coronary syndromes[J]. Am J Cardiol，2001，88（8A）：10.
[7] Blankenberg S， Rupprecht HJ， Bickel C， et al. Circulating cell adhesion molecules and death in patients with coronary artery disease[J]. Circulation，2001，104（12）：1336-1342.
（收稿日期：2013-01-22，编辑：华强）
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